虎粪便类固醇激素检测及影响因素的评估

傅文源

(福建梅花山华南虎繁育研究所，龙岩，364201)

粪便的主要成分包括食物残渣、肠道微生物、脱落的肠上皮细胞、细菌发酵产物、电解质以及微量的激素等。野生动物研究中，因为收集粪便相对容易，且不损伤动物，所以，粪便成分分析就成为常用研究手段，如分析动物的食性［1－2］、肠道微生物群落结构［3］、寄生虫［4］、病原体［5］、DNA 信息［6］、矿物质元素［7］等。此外，激素是粪便分析的一个重要方面，通过分析肾上腺皮质激素来了解动物的应激性［8－9］，以及通过性激素的分析来判断动物的繁殖生理状态［10－14］都是常见的研究策略。

粪便激素分析受到很多因素的影响，如粪便不同部位激素的含量存在差异［15］，粪便所处的环境温度、湿度、从排出到采集的时间长短以及是否受到尿液或其他污染［16］等，也是造成激素含量波动的主要原因。

虎(Panthera tigris)是重要的濒危物种，性情凶猛，研究其繁殖活动时，主要依据粪便中的性激素含量［12］。虎的粪团较大，且含有较多的毛发，基本具备了与大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)粪便类似的结构:表层含有更多的肠道脱落细胞和黏膜碎片。如果像大熊猫一样［15］，粪团内激素非均一分布，则激素分析时样品择取部位就会对结果产生影响。动物的生理具有明显的日节律。如果一天之内不同时间排出的粪便激素含量存在较明显的差异，那么，这直接就会成为用粪便激素来监测动物生理状况时的一个影响因素。此外，虎时而会排出巧克力状粪便，这类粪便中的激素含量也可能与正常粪便有所不同。但是，上述因素的影响在虎的粪便激素分析中尚未被系统评估，进而影响对激素检测结果的解析。

本研究以人工饲养的东北虎(P.t.altaica)和华南虎(P.t.amoyensis)的粪便为材料，针对粪便的不同部位、采集时间、粪便含水量这3个因素，研究其对性激素分析效果的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2013年5月中旬至12月底，从上海动物园、福建梅花山华南虎繁育研究所采集9只成年雌性华南虎粪便样品;2013年1月上旬至2014年3月上旬，从黑龙江东北虎林园采集18只成年雌性东北虎粪便样品;2014年6月底至9月中旬从中国横道河子猫科动物饲养繁育中心采集6只成年雌性东北虎粪便样品。所有的虎都曾繁殖过至少1胎，处于较佳的健康状态。

1.2 粪便样品的采集

采集前一天将内舍地面用清水冲洗干净，傍晚把虎收回舍内，翌日清晨5:00开始检查排便情况。在粪便排出后30 min内采集完毕。操作时，用镊子夹取粪团，小心装入封口袋中。每采集一次，镊子用卫生纸和酒精棉擦拭干净。用油性记号笔在封口袋上标记虎的编号、采集日期和地点等信息。同时在实验记录本上记录粪便样品的基本信息，包括采集地点、虎的编号、采集日期、温度、粪便形状、干燥和稀便等。采集后将样品袋放入冷藏箱中暂存2～3 h后，转入－20℃冰柜内保存。

1.3 粪便类固醇激素的提取与测定

1.3.1 粪便类固醇激素的提取

粪便中孕酮、雌二醇、睾酮等类固醇激素的提取参考郎冬梅等［17］、李琼［18］提取激素的方法，并进行了改进。将粪便从－20℃冰柜中取出，室温下解冻。剔除毛发、骨头碎片、植物碎片等杂物后，置于研磨钵中，充分研磨粉碎并混合均匀。用电子天秤称取约1.5 g样品于15 mL离心管中，加入10 mL浓度为90%的甲醇溶液，在涡旋震荡仪上充分震荡1 min，置于60℃的恒温水浴锅中温浴20 min。之后在离心机中以2000 rpm离心10 min，取上清液于新的离心管中，置于－20℃下保存备用。

同时，取大小约为10 cm ×10 cm的洁净牛皮纸若干，于105℃下烘至恒重。取10 g左右同一粪便样品，放置于已知重量的牛皮纸上，在分析天平上准确称重后，扣除牛皮纸的重量，得到粪便的湿重。将粪便放入烘箱中105℃烘至恒重，然后计算粪便含水量。再按照含水量推算每份提取激素的粪便样品的干重，用于计算激素含量(ng/g_dry或μg/g_dry)作为最终结果。

1.3.2 类固醇激素的测定方法

采用酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定上述各待测样品。测量前将孕酮、雌二醇和睾酮待测样品用pH=7.4的0.02 mol/L的磷酸缓冲液稀释5×，然后用96孔酶联免疫诊断试剂盒(北京北方生物技术研究所)对睾酮和雌二醇进行测量，操作按照说明书进行。先重复测定2个数据，遇到有两个结果相差较大的数据重新检测。

所用试剂盒主要参数包括:孕酮测定范围0～20 ng/mL，灵敏度≤0.005 ng/mL，变异系数CV＜15%，与孕酮、雌二醇、DHT没有交叉反应;雌二醇测定范围0～1000 pg/mL，灵敏度≤25 pg/mL，变异系数CV＜15%，与孕酮、雌三醇无交叉反应;睾酮测定范围0～20 ng/mL，灵敏度≤0.005 ng/mL，变异系数CV＜15%，与孕酮、雌二醇、DHT没有交叉反应。

1.4 数据处理

运用Microsoft Excel 2003对每个样品测得的OD450nm值进行初步整理，通过标准曲线的方程用OD值计算出激素的浓度值，然后根据粪便样品的干重计算出干粪中所含测量指标的浓度，其中每种激素在检测时均符合标准曲线，r2值均大于0.98，证明ELISA方法可靠。用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，各组数据的特征用均值±标准差的形式表现。

因为样品采集时间跨度较长，为了消除虎生理时期激素水平的影响［19］，均采用同一个样品不同部位之间的比较，或者同一只个体同一天上午和下午所排粪便之间进行比较。多重比较采用单因素重复测量方差分析(One-way repeat measure anova)，首先通过箱式图的方法对3个部位的激素含量是否有异常值进行检验，通过Shapiro-Wilk方法对是否近似符合正态分布进行检验，采用Mulchily's test检验是否符合球形假设。对不符合正态分布的数据通过Log转换进行正态化后再进行检验。最后，进行单因素重复测量多重比较，置信度进行 Bonferroni校正，即 α=0.05/2=0.025。以Pearson's correlation test进行双变量相关分析，显著性水平均设置为α=0.05。

2 结果

2.1 粪便不同部位3种类固醇激素的含量差异

本部分研究以2013年5月中旬至12月底，从上海动物园、福建梅花山华南虎繁育研究所采集的9只成年雌性华南虎粪便样品为材料。对粪便表层及内部的3种类固醇激素水平测定结果如图1A。粪团表层睾酮含量为(99.38±35.52)ng/g干重，中层含量为(102.92±51.74)ng/g干重，中心的含量为(77.49±31.07)ng/g干重。通过对数转换将数据正态化后进行单因素重复测量方差分析，结果显示，数据满足球形假设(χ2=0.345，P=0.841)，且各个水平总体上无显著差异(F=1.614，P=0.239)。多重比较显示，粪便表层与中层之间(P=1.000)、中层与中心之间(P=0.282)、表层与中心之间(P=0.824)亦均无显著差异。

粪团表层雌二醇含量为(421.84±104.19)ng/g干重，中层含量为(293.72±158.68)ng/g干重，中心的含量为(365.72±125.33)ng/g干重。通过对数转换将数据正态化后进行单因素重复测量方差分析，结果显示，数据满足球形假设(χ2=2.239，P=0.326)，且各个水平总体上无显著差异(F=1.581，P=0.253)。多重比较显示，粪便表层与中层之间(P=0.316)、中层与中心之间(P=1.000)、表层与中心之间(P=1.000)亦均无显著差异，如图1B。

粪团表层孕酮含量为(2.04±2.27)μg/g干重，中层含量为(1.04±0.96)μg/g干重，中心的含量为(2.12±2.14)μg/g干重。通过对数转换将数据正态化后进行单因素重复测量方差分析，结果显示，数据满足球形假设(χ2=5.595，P=0.061)，且各个水平总体上无显著差异(F=1.511，P=0.267)。多重比较显示，粪便表层与中层之间(P=0.128)、中层与中心之间(P=1.000)、表层与中心之间(P=1.000)亦均无显著差异，如图1C。

图1 华南虎粪团不同部位3种类固醇激素含量的差异Fig.1 Comparisons of the contents of three steroid hormones among different sections of the south China tiger fecal pellets

以上结果显示，睾酮在粪团中的分布呈现出从外层到中央逐渐递减的趋势，但是相邻部分之间无显著差异，说明是一种渐变的状态。其他两种激素并未呈现出这种趋势。因此，为了在实际操作中减少测定结果的变异性，后续试验中将粪便进行了均质化处理，即将整个粪团进行搅拌混匀后随机获取分析样品。

2.2 采集时间对激素含量测定结果的影响

本部分研究以2014年6月底至9月中旬在中国横道河子猫科动物饲养繁育中心采集6只雌虎粪便样品为材料，同一个体分别采集了上午(8:30～10:30)和下午(15:00～17:00)两个时间段排出的粪便，经过均质化处理后随机采样进行激素检测。

对比分析发现雌二醇含量在上午和下午之间无显著相关性(r=0.384，P=0.523)，同时检测到雌二醇含量在上午略高于下午，但未达到显著差异(均值上午=(17.797±21.899)μg/g_dry，均值下午=(6.678±3.731)μg/g_dry，t=1.198，P=0.297)。也就是说，雌二醇水平的高与低与上、下午采集的粪便没有直接的关联性，也没有明显的差异性。

与雌二醇相反，孕酮含量在上午粪便和下午粪便之间有着极显著的相关性(r=0.992，P=0.001)。同时，上午粪便中的含量显著高于下午粪便的含量(均值上午=(5189.992±7365.555)ng/g_dry，均值下午=(3612.589 ±7136.482)ng/g_dry，t=3.765，P=0.020)。

粪便中睾酮含量在上午和下午之间有着极显著的相关性(r=0.989，P=0.001)，上午样品的含量略高于下午，但是未达到显著水平(均值上午=(287.096±465.516)ng/g_dry，均值下午=(129.901±234.442)ng/g_dry，t=1.487，P=0.211)。

这一结果显示，粪便排出后，在环境中存放时间对性激素的水平存在一定的影响，因为大部分虎都在晨间排便，而且该粪便是上一次排便后至本次排便前大约24 h积累效应，因此更为有效。下午所排粪便有的是一天之内的首次排便，有的是第2次排便。因此二者之间有着较大的差异。鉴于大部分虎都是早上排便，而早晨所排粪便中激素含量较高，有利于分析动物的生理状态，建议采用上午采集的粪便作为正式试验的样品。

2.3 粪便的性状对测定结果的影响

因为虎的粪便经常在同一粪团上，有些部分比较干燥、成形，而另一部分水分较大，比较黏稠，且无固定形状。选取2013年1月上旬至2014年3月上旬从黑龙江东北虎林园采集18只成年雌性东北虎粪便样品，研究粪便中较干的有形部分和较为黏稠的无形部分进行激素含量的比较分析。从变化趋势上看，有形部分和无形部分的雌二醇含量之间没有显著的相关性(r=0.132，P=0.602)，而孕酮和睾酮两种激素在有形和无形的部分则有着极为显著的相关性(r孕酮=0.800，P=0.000;r睾酮=0.797，P=0.000)。

经配对样本t检验，发现雌二醇在粪便有形部分均值为(232.093±178.807)μg/g_dry，无形部分均值为(276.713±152.542)μg/g_dry，二者之间无显著差异(t=－0.864，P=0.400)。孕酮含量在有形部分均值为(10.171±14.100)μg/g_dry，无形部分均值为(8.025±9.669)μg/g_dry，二者之间无显著差异(t=0.974，P=0.344)。睾酮含量在有形部分均值为(101.654±140.000)ng/g_dry，无形部分均值为(69.452±42.653)ng/g_dry，二者之间无显著差异(t=0.928，P=0.366)。

3 讨论

粪便的形成在大肠后段，主要成分是食物残渣、细菌和肠道脱落物等。在粪便形成早期，随着肠道的蠕动，各类组分得到充分混合，而进入肠道后段随着水分重吸收，逐渐成形、硬化。硬化后的粪便会在肠道内保存较长时间，此时粪便一部分与肠管有不同程度的接触，而有些部分则再无机会与肠管接触，至此，就会形成结构性差异，进而影响类固醇激素的分布，这在很多草食动物的研究中得到证实。譬如大熊猫粪团中不同部位雌二醇、睾酮、皮质醇激素的含量不同［15］。

可以推测，粪便中的类固醇激素主要来源于肠组织，其浓度与血液中同种激素的水平直接相关［20］。可以推测，随着时间的延长，与肠黏膜直接接触的粪便表层可能积累较多的激素，而粪便中心部分则含量相对较少。本研究的结果显示，睾酮、雌二醇和孕酮的含量在粪便表层、中层和中心之间未检测到显著差异(P=0.061～0.253，图1)，这提示，在检测雌虎粪便中类固醇激素含量时，可以不考虑不同部位的含量差异。因为虎粪便含有大量被毛时，结构相当紧实，刻意获取外层粪便时操作比较复杂。所以，不考虑部位差异性可以提高操作的便捷性。

粪便在比较温和的环境中(如室温条件下)存放时间长短对激素含量的影响已有很多研究。粪便中的孕酮在室温下24 h内会发生显著的降解［21］。在有氧状态下雌二醇的半衰期仅为4～12 h，而在无氧环境下降解极为缓慢［22］。当新鲜粪便暴露在空气中时，最外面的激素处于有氧状态下，如果未能立即进行无氧处理，都会在短期内丧失殆尽。而表面以下的激素，如果粪团比较紧密而处于无氧状态，就会得到有效保留，如果比较松散，则会逐渐降解。一些实验无论在室温下还是在低温下保存粪便都发现较多的降解，可能与此有关［23－26］。同时，激素在肠道和粪便中的消解主要因为微生物的作用［27］，因此，样品保存中通过低温等方式抑制微生物的活力是非常必要的。

虎夜间排便较少，更多的是在清晨。此时的粪便应该在肠道存留时间较长，积累的激素总量可能较多。那么在肠道期间就会形成一边积累、一边消解的动态局面。如果粪便中检测到较高的激素水平，表明激素分泌和累积的速度整体上高于消解的速度。下午所排粪便往往是在上午排便之后重新形成的，激素累积时间较短，则其表观的激素水平就会略低。本研究中，3种类固醇激素在上午所排粪便中的含量均略高于下午所排粪便，符合这一趋势，但只有孕酮达到了显著水平(t=3.765，P=0.020)，所以，除了孕酮之外，另外两种激素并不太受排便时间的影响。所以，如果只检测雌二醇和睾酮时，则采用上午或下午的粪便均可，但要检测孕酮，则必须确定一个一致的粪便排出时间，避免更多的误差。在实际工作中，因为大多数虎都会在早晨排便，为了便捷起见，可以统一采用早晨排出的粪便。

粪便含水量的差异一直是影响激素检测的重要因素。因此，为了消除含水量引起的误差，最后都统一换算成单位干重粪便中的含量［15］。从粪便形成过程来看，含水量越高，粪便越稀，表明在肠道中保留的时间越短，激素积累的量会越少。但本实验结果否定了这一推测，同一个粪便中较干燥的部分和较黏稠的部分中，类固醇激素含量没有显著差异。也就是说，粪便激素只要积累时间和消解速度一致，无论含水量多高，换算成干重含量时检测结果不受影响。

综合上述结果，我们建议在通过粪便监测虎类固醇激素水平时，首先要确定粪便采集的时间，最好采集早晨的粪便;第二，鉴于激素分布有差异倾向，以及不同含水量对干重含量没有影响，建议分析时将整个粪便样品做均质化处理，然后随机取样。

致谢:本研究中东北林业大学的石许秀、马跃、徐艳春等在实验中提供了很多帮助，上海动物园的袁耀华、刘群秀、李清，黑龙江东北虎林园的刘丹、马国庆，福建梅花山华南虎繁育研究所的林开雄、兰作闽等在样品采集中给予了大力协助，在此对上述单位和个人表示衷心感谢。

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