血清缺血修饰白蛋白与大鼠应激性心肌病相关性分析

尹元立，高永红

随着社会生活节奏的加快及工作压力增大，心脏不良事件发生率逐年增加且有年轻化趋势，尤其在发达国家更为明显[1]；原因之一是在各种强烈的应激因素如熬夜、不良负面情绪等刺激下导致体内儿茶酚胺急剧分泌[2,3]，造成心脏结构和功能异常，诱发应激性心肌病（TTC）。现有研究认为该疾病具有较严重的并发症如恶性心律失常、心脏破裂，甚至猝死发生[4]，所以被广泛关注。因此深入研究该疾病的发病机制，对于降低心脏不良事件发生具有重要意义。

TTC常表现为心电图ST段抬高伴有心肌酶升高，左心室可呈气球样膨胀，而冠状动脉未见明显狭窄。已有研究发现脑利钠肽（BNP）及肌钙蛋白I（CTN-I）与该疾病相关[5]，但遗憾的是临床中常用检测手段，不能确定该疾病严重程度及心肌细胞损伤程度，故缺少临床诊断及预后判断价值。本研究发现缺血修饰白蛋白（IMA）在该疾病早期即可表达升高，且与该疾病发生后心肌细胞损伤程度及疾病严重程度相关，现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料实验大鼠均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，所有的动物护理和程序符合美国国立卫生研究院的指导方针，氯化钴（CoCl2.6H2O 美国AMRESCO），二硫苏糖醇（DTT Pharmabiology），722分光光度计（上海域仪器厂），酶促试剂盒购自北京冬歌生物，大鼠心电图机（湖南鼠行RM6280C），ADVIA2400全自动生化分析仪（美国西门子）。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌病动物模型制备雄性SD大鼠（220～250 g，8周）120只按随机数字表法随机分为3组，空白组与对照组各30只，TTC组60只。其中TTC组给予大鼠异丙肾上腺素（100 mg/kg/d）不同部位多点皮下注射，持续3周心脏彩超验证心脏外形呈现“章鱼篓”且伴有心室中段及心尖部运动减弱证实造模成功，造模成功后停止异丙肾上腺素注射并正常进食饲养1周；对照组给予大鼠生理盐水（100 mg/kg/d）不同部位多点皮下注射持续3周，3周后停止注射生理盐水并正常进食饲养1周；空白组：无干预措施。

1.2.2 大鼠心电图及心脏超声检测分别在实验第3周及第4周对各组大鼠进行心电图及心脏超声测量大鼠心尖段，心中间段及心基底段的短轴收缩率（FS），大鼠左心室收缩末期内径（LVESd），射血分数（EF）及心电图变化评价心脏功能。

1.2.3 检测大鼠缺血修饰白蛋白（IMA）及心肌损伤标准物水平分别在实验第1、2、3周用Bar-Or's方法通过ACB测试来测量IMA的水平，取大鼠血清200 μl放于试管中，再加0.1%如氯化钴50 μl搅匀后加入DTT 50 μl，静置2 min后加入0.9%氯化钠1 ml，将其与不含DTT的血清-钴空白对比并记为吸光度单位（ABS）。分别在实验第1、2、3周取各组大鼠血液，血液凝结后将样品离心，并将血清立即储存在-80℃备用。使用美国西门子ADVIA2400全自动生化分析仪检测心肌损伤标准物肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）及肌钙蛋白I（cTn-I）水平。

1.2.4 心肌损伤组织学检测实验第3、4周分别处死半数大鼠，取心脏组织标本固定在10%中性福尔马林溶液中并包埋在石蜡中，用HE染色分析心脏组织损伤情况，并根据组织损伤程度进行评分，具体评分标准如下（表1）。

1.3 统计学处理实验数据采用SPSS 19.0软件进行处理，计量资料采用均数±标准差表示（±s），多组比较采用F检验；两两比较t检验；计数资料采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

表1 HE染色心肌组织损伤评分表

图2 各组实验大鼠心电图比较

2 实验结果

2.1 心电图及心脏超声检查结果通过持续异丙肾上腺素注射诱导制备TTC大鼠模型，应用心脏彩超观察实验动物心脏结构改变发现，TTC组与空白组及对照组比较明显出现左心室中段膨出，且伴有心电图ST段明显抬高（P＜0.05），去除应激因素正常饲养1周后，左室形态恢复且心电图ST段回落趋于正常（图1～2）。同时通过心脏功能测定发现，TTC组与空白组及对照组比较，大鼠左心各段包括心尖段、室壁中间段及心基底段的FS%明显下降（P＜0.05），LVEF亦明显下降，而左心室收缩末期内径（LVESd）增加（P＜0.05），去除应激因素后1周（第4周）各组大鼠再次心脏超声检查发现，TCC组实验大鼠心脏各段FS%、LVEF及LVESd趋于正常（表2）。

2.2 大鼠血清缺血修饰白蛋白（IMA）及心肌损伤标志物水平检测按实验设计分别在第1、2、3周分别对各组大鼠血清中IMA表达水平及心肌损伤标准物CK、CK-MB及cTn-I水平进行检测，结果显示TTC组与空白组及对照组相比较心肌损伤标准物在实验第1～3周均无统计学差别，而相反IMA表达水平在应激后第1周时即出现了明显升高情况（P＜0.05）且IMA表达水平随应激时间的延长而进一步出现表达升高（P＜0.05）（表3）。

2.3 心肌损伤组织学检测在第3、4周分别处死各实验组半数大鼠（空白组及对照组15只大鼠，TTC组30只大鼠）获取心肌组织并进行切片及HE染色，结果显示TTC组大鼠在第3周出现明显心肌损伤，表现为心肌组织炎性细胞浸润、细胞水肿明显、部分心肌组织出现局灶性出血及纤维化发生，损伤主要局限于心室的心尖部，很少达到心脏基部，而在第4周随着应激因素的解除，部分损伤心肌组织有所恢复（图3）；通过显微镜下观察并按照损伤程度进行评分发现空白组及对照组比较，TCC组大鼠心肌损伤评分明显增加（P＜0.05）（表4），而到第4周时随着应激因素的解除心肌损伤程度评分有所降低。

2.4 IMA表达水平与心肌损伤程度及心脏功能相关性分析通过对IMA表达水平与LVEF采用Pearson相关分析发现，IMA表达水平与LVEF两者呈明显负相关关系（r=-0.543，P=0.0103）（图4A），LVEF越低则IMA表达水平越高；进一步对IMA表达水平与心肌损伤程度评分进行Pearson相关关系分析，发现IMA表达水平随心肌损伤程度加重而表达水平增高，两者呈正相关关系（r=0.443，P=0.0267）（图4B）。

表2 各组大鼠左心各节段FS%、LVESd及LVEF比较（±s）

表2 各组大鼠左心各节段FS%、LVESd及LVEF比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

项目 空白组（n=30） 对照组（n=30） 应激性心肌病组（n=60）第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=30） 第4周（n=30）心尖段（FS） 43.65±2.64 43.11±2.55 47.62±3.15 47.31±3.77 7.31±0.31ab 46.81±2.98心中间段（FS） 28.82±3.81 28.99±3.53 30.77±4.92 30.29±4.26 14.11±1.82ab 31.47±4.36心基底段（FS） 21.91±2.33 20.73±2.68 23.67±3.99 23.27±4.23 53.72±2.73ab 20.58±3.42左心室收缩末期内径LVESd（mm） 5.98±0.34 6.15±0.46 6.31±0.59 6.61±0.98 8.41±0.75ab 6.52±0.62左室射血分数LVEF 78.93±5.32 78.36±5.82 73.08±6.78 75.33±7.31 39.34±1.59ab 43.89±5.99

表3 各组大鼠血清中缺血修饰白蛋白及心肌损伤标志物比较（±s）

表3 各组大鼠血清中缺血修饰白蛋白及心肌损伤标志物比较（±s）

注：IMA：缺血修饰白蛋白；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTn-I：肌钙蛋白；与空白组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

项目 空白组（n=30） 对照组（n=30） 应激性心肌病组（n=60）1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=15） 1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=15） 1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=30）IMA（ABSU） 0.41±0.091 0.409±0.054 0.411±0.092 0.419±0.098 0.413±0.085 0.421±0.071 0.751±0.098ab0.832±0.063ab0.934±0.055ab CK（U/L） 827.13±361.78 815.16±348.75 823.79±350.56 805.25±331.72 836.37±306.87 818.35±311.41 906.15±416.82 1032.85±458.38 2945.85±1765.38 CK-MB（U/L） 865.37±309.21 837.37±287.52 851.28±291.21 879.28±312.45 801.52±234.35 825.95±301.15 956.18±398.21 1039.89±413.25 1988.32±898.41 cTn-I（μg/L） 0.34±0.15 0.28±0.09 0.31±0.14 0.34±0.13 0.22±0.08 0.25±0.06 0.68±0.07 0.82±0.21 0.92±0.41

3 讨论

TTC是1991年被Dote等发现在应激状态下诱发造成暂时性左心室功能不全一类心脏疾病。近年来通过调查发现该疾病发病率显着增加且复发率高达10.9%[6]，常伴严重的心脏不良事件发生，因此深入研究TTC的发病机制对于减少该病的发生具有重要意义。

图3 各组大鼠心肌组织病理切片比较

表4 各组大鼠心肌组织损伤积分情况（±s）

表4 各组大鼠心肌组织损伤积分情况（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

评分 空白组（n=30） 对照组（n=30） TTC组（n=60）第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=30） 第4周（n=30）总分 1.00±0.23 1.03±0.31 1.01±0.12 1.03±0.11 9±0.46ab 4±0.32ab

缺血修饰白蛋白是近年来发现在缺血/再灌注发生时存在于血清中的一类蛋白，常在心肌缺血早期即可被检出[7]，以往的报道中发现缺血修饰白蛋白与心肌梗塞、急性冠脉综合征及脑梗塞均有相关[8-11]，但该蛋白在TTC中的报道尚不多见。

通过异丙肾上腺素持续注射诱导大鼠形成TTC模型，通过心脏彩超和心电图检测发现TTC组大鼠心脏左心室明显膨出，并伴有心电图ST段明显抬高，且左心各段FS%及LVEF明显下降、LVESd增大，去除应激因素后以上指标逐渐恢复正常，符合其病理生理演变过程。通过对各组大鼠血清中IMA及常规心肌损伤标志物测定发现，IMA相对于常规心肌损伤标志物在疾病早期（第1周）即出现了明显的改变且随应激的时间延长该蛋白表达进一步增高。通过大鼠心肌组织切片观察发现在TTC发生时，大鼠心肌组织明显损伤。进一步通过Pearson相关分析对大鼠心肌损伤程度与IMA表达水平分析发现，两者呈现明显正相关关系，而通过LVEF与IMA表达水平相关分析发现，两者呈负相关关系，提示IMA表达水平与TTC心肌损伤及心脏功能改变明显相关值得进一步研究。

图4 缺血修饰白蛋白与左室射血分数及心肌损伤评分相关关系

综上所述，缺血修饰白蛋白（IMA）在TTC中表达水平明显升高，且与该疾病发生后心肌损伤程度及心功能变化明显相关，有较高临床早期诊断及病情评估价值。

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