桂枝茯苓丸对大鼠子宫内膜异位症血管生成的抑制作用及机制研究

林立鹏 刘泽滨 吴晓宾

子宫内膜异位症(Endometriosis)是一种妇科常见病，但目前对其发病机制没有较好的叙述，不过目前认为其依赖于血管生成和血液供应[1]。目前对子宫内膜异位症的发病机制进行深入研究，而随着研究不断进行，社会各界基本已经认定了子宫内膜种植学说。桂枝茯苓丸本身具有活血化瘀功效，用于子宫内膜异位症治疗，但其具体作用机制不明[2]。本研究主要通过大鼠在服用桂枝茯苓丸后体内VEGF和HIF-1α变化情况，进行桂枝茯苓丸作用机制研究。

1 实验材料

1.1 药物和试剂

桂枝茯苓丸：由桂枝、牡丹皮、桃仁、茯苓、赤芍各9 g构成[3]。

孕三烯酮：孕三烯酮胶囊(北京紫林药业有限公司，2.5毫克/粒，批号：国药准字H19980020)。

1.2 实验对象

雌SD大鼠共40只，均选自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005，饲养环境温度在25 ℃，相对湿度60%，大鼠均自由进食、饮水[4]。饲养足月后，确保大鼠体重在180～200 g，建立大鼠子宫内膜异位症模型，此外无其他疾病，且大鼠均能正常摄取药物。

1.3 仪器

电子天平(德国)、BX41型显微镜(日本)和ABI7500型实时定量PCR仪(美国)。

2 方法

2.1 造模分组以及给药

共40只大鼠，其于按照标准分为4组。模型对照组不给予任何药物；低剂量桂枝茯苓丸组每天给予0.5 g桂枝茯苓丸；高剂量桂枝茯苓丸组每天给予3.0 g桂枝茯苓丸；孕三烯酮组每天给予孕三烯酮2 g。其中桂枝茯苓丸ig,1天1次；孕三烯酮,ig，1周2次，共治疗4周。治疗4周后，将所有大鼠全部处死，并获取每个大鼠异位子宫内膜，将所有标本分为2份，进行PCR检测[5]。

2.2 VEGF含量测量

采用ELISA法，处死大鼠后，切开腹膜，往大鼠腹腔内注入生理盐水，摇动大鼠，直至腹腔全部充满。收集灌洗液，在4 ℃和500 r/min环境下离心10 min，利用上层清液测定VEGF含量[6]。

2.3 HIF-1α中mRNA的表达检测

采用PCR法。将内膜组织放入玻璃匀浆器，研磨至出浆。加入微量三氯甲烷，震荡后静置，在4 ℃和12 000 r/min环境中离心10 min。将上层清液移至新EP管中，加入异丙醇，混匀后静置10 min，再次离心15 min，弃上清液。向沉淀物中加入1 mL DEPC水和乙醇混合液，再次离心，弃上清液。自然干燥后加水溶解，冷冻存储[7]。

2.4 PCR检测

根据实际和说明书，可得到下列引物列表，见表1。

表1 引物序列

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠VEGF表达

模型对照组VEGF阳性率表达最高，而高剂量桂枝茯苓丸VEGF阳性率表达最低，见表2。

表2 各组大鼠VEGF表达 (%)

注：1)数据明显高于其他组，P<0.05；2)数据明显低于其他组，P<0.05

3.2 各组大鼠HIF-1α表达

模型对照组HIF-1α最高，高剂量桂枝茯苓丸HIF-1α最低，见表3。

组别nHIF-1α模型对照组10139±271)低剂量桂枝茯苓丸10109±13高剂量桂枝茯苓丸1082±142)孕三烯酮组10114±8

注：1)数据明显高于其他组，P<0.05；2)数据明显低于其他组，P<0.05

4 讨论

随着分子生物学的发展出现，血管生成理论得到进一步发展，越来越多证据表明血管生成在子宫内膜的生长修复中起到很大作用，而且在子宫内膜异位症的治疗和发展中占据重要位置[8]。新生血管可以为子宫内膜异位病灶提供所需氧气和营养物质，血管生成是子宫内膜病灶增殖和种植的必要条件。单核巨噬细胞在免疫反应中起到重要作用，能够反馈免疫应答。当外来细胞进入人体后，单核巨噬细胞提供识别作用，也为向T细胞提呈抗原作用。在腹腔当中，巨噬细胞会通过自身功能对外来细胞进行消除，以及对细胞碎片进行吞噬。在本次实验研究中，可以发现巨噬细胞数量明显增加，当其功能被过度激活时，TNF-α、IL-8和VEGF水平也会大幅度增加。在后续研究中发现，影响腹腔中子宫内膜上巨噬细胞增多的原因有以下几个方面： ①子宫内膜异位患者腹腔液成分与正常人有所差异，极有可能导致巨噬细胞活性程度增加；②子宫内膜异位组织分泌的活性物质导致巨噬细胞活性增强。而且在子宫内膜异位患者当中，巨噬细胞凋亡率会大大降低，而且生命周期会出现一定程度改变。在基因表达中，Bcl-2基因表达大大增强，而Bax基因表达受到抑制，会使细胞抗凋亡能力进一步增加。

IL-8与VEGF类似，都是单核巨噬细胞分泌的一种细胞因子。血管新生本身具备多个复杂步骤，需要多个生长因子和细胞因子参与，特别是VEGF，是刺激生长的关键因子[9]。在本次研究中发现，患有子宫内膜异位症大鼠腹腔液中VEGF的含量明显高于正常大鼠。而且根据之前研究显示[10-11]，子宫内膜异位症严重程度与腹腔液中分泌的VEGF含量呈正相关，而本次实验中，模型对照组VEGF阳性率表达最高，而高剂量桂枝茯苓丸VEGF阳性率表达最高，而且经过桂枝茯苓丸28 d治疗后，子宫内膜异位症大鼠腹腔液中VEGF含量出现下降趋势。其次，在HIF-1α的mRNA检测中发现，桂枝茯苓丸可以抑制VEGF表达。

桂枝茯苓丸是一种中成药，也是一种理血剂，具有活血、化瘀、消癥等功效。该药物主要包含桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍药等中药材，其中桂枝主要可以能够散寒止痛、温经驱寒、活血化瘀、温养经络；茯苓可以健脾静心、利水渗湿，有利于腰脐间血；丹皮、芍药、桃仁也可以帮助患者活血化瘀，此外芍药还具有养血活血的功效。子宫内膜异位症会经历一个缺氧环境，在HIF-1α和VEGF形成的通路之下，降低氧含量会促进血管生成因子的出现。而且在氧气不足的条件下，环境会促进VEGF表达，而桂枝茯苓丸会调整异位病灶中HIF-1α表达水平。

子宫内膜异位症在转移这一特点上与恶性肿瘤类似，其中，细胞基质的降解和重建是关键因素。桂枝茯苓丸是治疗子宫内膜异位症的传统中药方，无论是单独使用还是与西药结合使用，均能取得良好的治疗效果，在短时间减轻/缓解内子宫内膜异位症患者疼痛，缩小内膜异位肿块。此外，桂枝茯苓丸还能够有效缩小异位内膜组织。桂枝茯苓丸被患者服用后，可让患者前列腺素得到有效平衡，缩小与正常人前列腺素差距。而且桂枝茯苓丸还有一定缓解子宫平滑肌痉挛的作用。在子宫内膜异位患者中，桂枝茯苓丸能直接明显的降低MMP-2和MMP-9在子宫内膜异位组织中的表达，之后可以抑制子宫异位内膜的侵袭、转移和种植，从根本上解决子宫内膜异位症的致病原因，也从侧面反应出子宫内膜异位症多靶点特点。

孕三烯酮(Gestrinone)是一种中等强度激素类药物，具有很强的抗雌激素活性和抗孕激素活性的作用，主要通过抗雌激素的方式治疗子宫内膜异位症，约束病灶生长。在研究中发现，孕三烯酮能降低VEGF表达，限制病灶增长，其整体水平超过低剂量桂枝茯苓丸，但明显低于高剂量桂枝茯苓丸。但孕三烯酮却无法抑制HIF-1α表达，故而整体治疗效果要低于大剂量桂枝茯苓丸。此外，在其他研究中还发现，其作用类似于黄体酮，均会使子宫内膜失活并退化。通过以上结果，可以分析出，桂枝茯苓丸和孕三烯酮本身作用机制存在一定差异，桂枝茯苓丸不仅能够降低VEGF水平，还能够减少HIF-α表达，阻碍子宫内膜异位病灶区生长，使其内部血管生成出现阻碍，抑制子宫内膜异位症病情发展。而桂枝茯苓丸还具有一定对雌激素和免疫系统调节的作用，但更深层的作用机制还有待研究。

综上所述，桂枝茯苓丸能抑制子宫内膜异位症血管生成，其机制与抑制VEGF和HIF-1α有关。

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[3] 赵淑英.桂枝茯苓丸联合腹腔镜电凝术对子宫内膜异位症患者术后血清GSH-Px、Leptin水平及妊娠率的影响[J].中国临床实用医学,2017,8(4):40-42.

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