青藤碱对骨质疏松性压缩骨折家兔血清白细胞介素-1β及白细胞介素-17和骨生长分化因子2的影响

胡熙耀，万 超，许明军，刘敏娟，陈德森

(1. 湖北省十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000)

骨质疏松属内钙调节激素分泌失调的全身代谢性疾病，尤以50岁以上的绝经妇女为严重，患者因钙、磷、维生素及蛋白质等摄入不足，成骨和破骨代谢失衡，骨量减少、骨微结构改变、骨强度下降且脆性增加，在外力的作用下较易发生压缩骨折，严重影响患者生存质量[1-2]。在骨折愈合过程中，炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-17等常影响骨折局部微环境。IL-1β在诱导软骨细胞凋亡的同时，还会诱导产生IL-17，降解软骨细胞基质，降低成骨细胞活性，延缓骨痂形成[3]。而IL-17由活化的T 细胞产生，可增强破骨细胞活性并最终导致骨侵蚀[4]。骨生长分化因子2 (GDF2)具有诱导成骨分化和骨形成能力，可促进骨痂形成，在骨折愈合过程中扮演重要角色[5]。 中药治疗骨质疏松及骨折有独特的疗效，其中青藤碱是从青风藤的干燥根茎中提取的生物碱，具有镇痛、免疫抑制、抗炎、抗风湿及抗肿瘤等作用[6]。其常用制剂有青藤碱缓释胶囊、盐酸青藤碱注射液等，临床常用于治疗风湿、类风湿、骨性关节炎、骨质疏松及骨折等疾病[7]。本研究旨在通过观察青藤碱对骨质疏松性压缩骨折家兔血清IL-1β、IL-17和骨折处骨痂组织中GDF2的影响，探讨其作用机制，为其临床应用提供更多理论依据。

1 实验资料

1.1实验动物 SPF级雌性家兔36只，7月龄左右，体质量(3.5±0.5)kg，由十堰市太和医院实验动物中心提供，合格证号：4200593344。

1.2试剂及药品 水合氯醛(扬州市奥鑫助剂厂，批号： 015102913)，盐酸青藤碱肠溶片(烟台鲁银药业有限公司生产，批号： 2016122603)；IL-1β、IL-17和GDF2检测用ELISA试剂盒均由上海信则生物科技有限公司提供。

1.3模型建立方法 家兔适应性喂养1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，俯卧位固定，剃毛，于家兔髂嵴顶部上方和腰椎骶棘肌两侧采用双切口方法切开家兔背肌，分离出腹腔脂肪团中包埋的卵巢和子宫角。先结扎子宫角上部，然后摘除卵巢，摘除干净后回纳脂肪团，分层缝合背肌和皮肤，用双氧水消毒。术后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2 次/周，共4周[8]。术后自由摄食、饮水，在20～22 ℃、相对湿度40%～70%的条件下饲养。 4周后再参照张淑娴等[9]方法建立骨质疏松性压缩骨折模型，即用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，双氧水消毒，切开兔L1-5皮肤，分离背阔肌、棘间肌及韧带，从椎体侧前方剪断L1-5椎体前缘，术后椎体不做内固定，2周内强迫活动(6 h/d，因家兔的前肢不发达，后肢及脊柱背侧肌群、腹侧肌群比较发达，且生活体位多以半直立屈曲位为主，负重集中在后肢，动物清醒后，其觅食活动、强迫运动均会使椎体受压，脊柱在此负重状态下最终会出现压缩状态而形成骨质疏松性压缩骨折[10])。在术后2周时拍摄骨痂X射线片，发现椎体有明显压缩变短等病理改变为建模成功。将建模成功兔随机分为模型组、青藤碱A组、青藤碱B组，每组12只。

1.4干预方法 在骨质疏松性压缩骨折建模成功后，青藤碱A组和青藤碱B组用事先配制好的10%盐酸青藤碱肠溶片混悬液分别按每只家兔2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)的剂量灌胃，模型组按2 mL/(kg·d)剂量灌胃生理盐水，3组均1次/d，连续灌胃1个月。

1.5观察指标

1.5.1骨痂总评分 分别于灌胃10，20，30 d拍摄骨痂 X射线片，对骨痂生长情况进行评分。评分标准：断端边缘锐利整齐为0分，边缘模糊为1分，接近消失为2分，全部消失为3分；骨痂密度显示非常淡为0分，较淡为1分，较深为2分，非常深为3分；骨痂量无为0分，少量骨痂为1分，较多骨痂为2分，填满为3分。以上3项评分相加为骨痂总评分，分值越高说明愈合越好。

1.5.2血清IL-1β及IL-17水平 分别于灌胃前后取耳缘静脉血0.1 mL，采用双抗体夹心法检测血清IL-1β、IL-17水平。

1.5.3骨痂组织中GDF2表达情况 取血后处死家兔，剔取骨折处的骨痂组织，每组随机取6只兔的骨痂组织研磨后3 000 r/min离心15 min，取上清液，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测GDF2表达水平。

1.5.4骨痂组织中GDF2 mRNA表达情况 采用半定量RT-PCR 法检测。取剩余兔的骨痂组织，提取GDF2总RNA，反转录至cDNA，用GAPDH作为内参，PCR扩增，然后进行半定量分析。GDF2上游引物：5’-ACCGACTAAGCGTACTCTCGC-3’，下游引物：5’-GCAATCACATGCTCACGTCAG-3。 GAPDH上游引物：5’-GCATCCTAAGTACGGATGCCGTAC-3，下游引物：5’-GCACCTACTCCAAGATAGTAC-3。PCR 反应条件：95 ℃ 2 min 变性， 95 ℃、52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，扩增40个循环。检测时根据标准曲线得出GDF2的分子拷贝数，用GAPD H的拷贝数作为基数进行校正，以目的基因拷贝数/GAPDH拷贝数之比值表示GDF2 mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1各组兔骨痂生长评分比较 灌胃10 d后，X射线片显示3组均有少量骨痂生长，但3组综合评分均较低，且3组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃20 d和30 d后，青藤碱A组和青藤碱B组骨痂生长良好，断层边缘逐渐模糊或消失，骨密度大，综合评分均明显高于灌胃10 d和模型组(P均<0.05)，但青藤碱A组和青藤碱B组综合评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表 1。

表1 各组兔骨痂生长评分比较分)

注：①灌胃10 d比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组兔血清IL-1、IL-17水平比较 灌胃前，3组血清IL-1β、IL-17水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后，模型组血清IL-1β、IL-17水平无明显变化(P均>0.05)；青藤碱A组和青藤碱B组血清IL-1β、IL-17均明显低于灌胃前及模型组(P均<0.05)，但青藤碱A组和青藤碱B组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组兔灌胃前后血清IL-1、IL-17水平比较

注：①与灌胃前比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3各组兔骨痂组织中GDF2和GDF2 mRNA表达情况 灌胃结束后，青藤碱A组和青藤碱B组GDF2和GDF2 mRNA表达水平均明显高于模型组(P均<0.05)，但青藤碱A组和青藤碱B组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组兔骨痂组织中GDF2和GDF2 mRNA表达情况

注：①与模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

IL-1β和IL-17作为炎症因子，参与机体的炎症反应。其中IL-1β是一种较强的刺激骨吸收因子，随着绝经后妇女雌激素分泌量降低，机体对于IL-1β的拮抗作用降低，故骨吸收加速，导致骨质疏松的形成[11]。而IL-17可增强破骨细胞活性，破骨细胞会通过分泌大量水解酶来溶解骨质，使骨小梁变薄、断裂，最终形成骨质疏松[12]。IL-1β与IL-17在炎症反应中有联动关系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而产生一氧化氮，一氧化氮诱导软骨细胞凋亡，并能抑制软骨细胞增殖和合成蛋白多糖[13-14]；同时IL-1β还会使T 细胞活化，诱导产生IL-17而降解软骨细胞基质，降低成骨细胞活性而破坏骨微结构[15]。因此，抑制IL-1β与IL-17所造成炎性反应成为防治骨质疏松时骨质破坏及可能发生椎体压缩骨折的关键。

本实验首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨质疏松模型，再在此基础上建立椎体压缩骨折模型，目的是真实模拟老年女性骨质疏松性椎体压缩骨折病理进程。 结果发现，灌胃20 d和30 d后，青藤碱A组和青藤碱B组骨痂生长良好，综合评分均明显高于灌胃10 d和模型组；青藤碱A组和青藤碱B组血清IL-1β、IL-17均明显低于灌胃前及模型组。提示青藤碱可抑制IL-1β、IL-17表达，抑制软骨细胞凋亡，促进骨折愈合。

目前关于GDF2与骨质疏松的关系研究较少，GDF2为骨形态发生蛋白9，属于转化生长因子，能够诱导钙盐沉积，并可诱导间充质干细胞分化为骨、软骨[16]。本实验结果显示，青藤碱A组和青藤碱B组GDF2和GDF2 mRNA表达水平均明显高于模型组，提示青藤碱可诱导骨钙沉积，提高成骨细胞活性，促进骨痂形成。

综上所述，青藤碱可以通过抑制IL-1β、IL-17介导的炎性反应，提高GDF2诱导成骨分化和骨形成能力，从而促进骨痂生长而加速骨折愈合，为青藤碱用于治疗老年女性骨质疏松性椎体压缩骨折提供了一定依据。但本实验中不同剂量青藤碱未显示出作用差异，有待进一步研究。

[参考文献]

[1] 吴小川. 鹿瓜多肽注射液对高龄骨质疏松性骨折愈合的影响[J]． 实用药物与临床，2014，17(3)：356-358

[2] 李翔，张树桐，王翔，等. 骨质疏松或骨转移瘤致椎体压缩性骨折患者的MRI鉴别研究[J]. 吉林医学，2017，38(1)：44-45

[3] 杨惠琴，陈礼荣. 青藤碱对膝骨性关节炎兔关节液及血清白细胞介素lβ含量的影响[J]. 中西医结合学报，2008，6(12)：1275-1279

[4] 姚金丹，韩光红，胡敏，等. IL-17对破骨细胞中MMP-9表达水平的影响及其意义[J]. 吉林大学学报：医学版，2016，42(3)：462-466

[5] 罗进勇. 骨形态发生蛋白9促成骨的分子机制[J]. 重庆医学，2016，45(9)：1153-1355

[6] 张欣悦，高永翔. 青藤碱的免疫抑制和抗炎活性研究进展[J]. 湖南中医杂志，2016，32(3)：193-194

[7] 杨惠琴，陈礼荣. 青藤碱注射液对兔膝骨性关节炎关节液及血清 IL-6水平的影响[J]． 中医药导报，2007，13(10)：62-63；72

[8] 卢其腾，农小连，吴家昌，等. 去势联合地塞米松建立大鼠骨质疏松模型的研究[J]． 中国骨质疏松杂志， 2015，21(1)：34-38

[9] 张淑娴，郭新全，邱玉金，等. 兔椎体骨折动物模型制备的初步探讨[J]. 动物医学进展，2013，34(7)：131-134

[10] 崔健超，江晓兵，杨志东，等． 胸腰椎椎体骨折动物模型的研究进展[J]． 中国脊柱脊髓杂志，2015，25(7)：666-669

[11] 吴迎爽，朱亦堃. 吡格列酮对去卵巢大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 的影响及与骨代谢关系的实验研究[D]． 太原：山西医科大学，2012

[12] 邵泓达，汤光宇. 去势骨质疏松的发病机制研究进展[J]． 上海医学，2014，37(1)：94-96

[13] 朱书涛，刘洋，张明辉，等. 去卵巢大鼠骨组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素6水平与骨质疏松的关系[J]. 中国组织工程研究，2016，20(15)：2206-2211

[14] 罗浩，郑洁，权志博，等. 关节腔注射青藤碱对兔膝骨性关节炎血清NO等自由基代谢的影响[J]. 现代检验医学杂志，2014，29(2)：60-63

[15] 丁从珠，姚瑶，方芸，等. 青藤碱对胶原诱导的关节炎大鼠血清OPG/RANKL、lL-17含量的影响[J]． 南京中医药大学学报，2012，28(4)：330-333

[16] 马军，孙崇毅，刘庆鹏，等. BMP9在脊柱融合过程中的作用及其相关机制研究进展[J]． 现代医学，2014，42(6)：703-706