红树莓根茎水煎剂对昆明小鼠的急性毒性及安全性实验研究

孙玉珍,方毅,李书丹，于晓红*(.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 50040；.哈尔滨爱尔眼科医院，黑龙江 哈尔滨 50076；.齐齐哈尔中医院，黑龙江 齐齐哈尔 6000)

红树莓为蔷薇科Rasaceae悬钩子属Rubus．L半灌木性聚合浆果植物，俗称“托盘”“刺莓”“马林”“覆盆子”，是中药覆盆子家族的一员, 作为中药材应用已有数千年的历史。《本草纲目》中记载：“覆盆子气味甘、平、无毒；益肾脏，治阳萎，缩小便；有益肾固精、补肝明目之功效。”在国外，红树莓已被人们作为良好的防病保健水果食用，并具有悠远的药用历史[1]。民间红树莓也被广泛应用，根、茎、叶均为入药部位，有人将红树莓根茎煮水治疗各种肿瘤，成为民间广为流传的偏方、验方。目前对于红树莓的研究大多集中于其有效成分的开发或致力于国内种植方法的研究等[2-5]，而对于红树莓根茎抗肿瘤免疫机理方面的研究未见报道。基于前期就红树莓原液对免疫抑制小鼠的免疫调节机制进行的一系列实验研究，本课题组首先观察了红树莓根茎水煎剂对昆明小鼠的急性毒性及安全性，本文拟就其实验数据进行报道，以期为红树莓抗肿瘤免疫调节机制的实验研究及临床应用提供基础资料。

1 实验材料

1.1 实验动物及条件

选用清洁级昆明种(KM)健康适龄小鼠60只，体质量18.0～20.0 g，雌雄各占一半，购置于黑龙江中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(黑)2013-012。给药前和给药后实验小鼠雌雄均已随机分笼，自由饮水，常规饲养，室温22～26℃，湿度：50%～60%。

1.2 实验药物及制备

药物：红树莓根茎采摘于黑龙江省尚志市帽儿山。将红树莓根茎切成小段、粉碎，备用。红树莓根茎水煎剂(RRD)制备：取粉碎红树莓根茎300 g，加入装有5倍量清水煮水容器中，浸泡2 h，将浸泡液与药材一起用武火煮沸后改用文火100℃加热30 min，过滤，得药液，将药渣再加入5倍量的水，加热100℃30 min，过滤去药渣得药液，并将两次药液混合加热浓缩至54 mL，使生药含量为5.56 g/mL，装入药瓶并放入4℃冰箱中保存。此水煎剂由黑龙江中医药大学微生物学与免疫学实验研究室完成。

1.3 实验器材

电子分析天平，METTLEY TOLEDO瑞士；无菌操作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；恒温水浴锅，北京市医疗设备厂；自动平衡离心机，北京医用离心机厂。

2 方法和结果

2.1 预实验：半数致死量实验

2.1.1 预实验方法

取清洁级昆明种(KM)健康适龄小鼠20只，雌雄各占一半，随机分为正常对照组和红树莓根茎水煎剂组，每组各10只，分别给予标记，称体质量。红树莓根茎水煎剂组以最大浓度为5.56 g/mL、最大耐受容积为0.04 mL/g给小鼠1次灌胃，灌胃药量为222.4 g/(kg·d)给药后常规饲养，自由饮水；正常对照组灌胃同红树莓根茎水煎剂组等量生理盐水，其余处理同红树莓根茎水煎剂组。连续观察7天，测量红树莓根茎水煎剂对昆明小鼠的半数致死量(LD50)。

2.1.2 预实验结果

红树莓根茎水煎剂组小鼠给药后精神状态、反射活动稍有减弱，30 min后恢复正常。7天内红树莓根茎水煎剂组小鼠行为活动、饮食、大小便等与正常对照组比较无明显差异；未见小鼠死亡。依据文献[6-7]，因红树莓根茎水煎剂质量浓度和容积的限制,一次给药无法测出红树莓根茎水煎剂(RRD)对实验小鼠的半数致死量(LD50),为评价红树莓根茎水煎剂对实验小鼠的安全性，故进行最大给药量(MTD)实验。

2.2 最大给药量实验

2.2.1 最大给药量实验方法

本实验采取最大给药量(MTD)法，取清洁级昆明种(KM)健康适龄小鼠40只，雌雄各占一半，随机分为正常对照组和红树莓根茎水煎剂最大给药组，每组20只，分别给予标记，称体质量。最大给药组以最大浓度为5.56 g/mL、最大耐受容积为0.04 mL/g给小鼠灌胃，每天2次，灌胃药量为444.8 g/(kg·d)，灌胃间隔时间为8 h，其间前4 h不禁食,后4 h禁食，最后一次给药后常规饲养，整个实验过程均不禁水。正常对照组灌胃同最大给药组等量生理盐水，其余处理同最大给药组。连续观察7 d，在给药后的第1天、第4天和第7天分别称体质量。在禁食不禁水12 h后的第8天，称体质量，摘除小鼠眼球取血约0.7～1.1 mL，静置2 h，离心(3 000转/min,10～15 min),取上清夜，移入EP管中备用。脱颈椎法处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后，在无菌操作台解剖小鼠，剥离主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，剔除周围结缔组织和脂肪组织并称重，放入4%多聚甲醛固定。用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、GGT和BUN数值。用以下公式计算心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要脏器的脏器指数。脏器指数=脏器湿重/体质量(mg/g)。

2.2.2 观察实验指标

在实验过程中，每天两次定期观察实验小鼠，上午8：00点、下午2：00点，观察记录小鼠在给药后的精神状态、呼吸运动、行为活动、反射活动、饮水、进食、眼耳鼻分泌物、大小便排泄物、存活等情况；记录给药前和给药后第1天,第4天,第7天各组实验小鼠的体质量变化情况；检测小鼠血清中的ALT、AST、GGT和BUN数值；观察主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏病理形态学的改变情况；检查红树莓根茎对实验小鼠主要脏器指数的影响(若中间有小鼠死亡应及时进行解剖)。

2.2.3 统计学方法

采用SPSS22.0进行统计学分析，在数据资料符合正态分布的情况下，采用均数±标准差表示，应用t检验统计分析，以P<0.05具有统计学意义。

2.2.4 最大给药量实验结果

2.2.4.1 对小鼠一般状态及存活情况的影响

实验结果显示，最大给药组小鼠在第二次灌胃后，出现精神萎靡、反射活动减弱、大便次数增加，2 h后恢复正常，2 h内眼、耳、鼻、口未见有异常分泌物。连续观察7 d，最大给药组小鼠在精神状态、呼吸运动、行为活动、反射活动、饮水、进食、大小便等方面与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。观察期间无1例小鼠中毒死亡。

2.2.4.2 对小鼠体质量变化的影响

记录各组小鼠给药前和给药后第1天、第4天和第7天的体质量，最大给药组实验小鼠的体质量在灌胃后的第1天较正常对照组明显减轻(P<0.05)；但第4天、第7天的体质量增加，与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。结果见表1。

2.2.4.3 对小鼠血液生化学指标的影响

检测实验小鼠的血液生物化学指标，结果显示最大给药组小鼠的血清中ALT、AST、GGT和BUN的数值，和正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。其结果见表2。

2.2.4.4 对小鼠主要脏器指数的影响

解剖分离实验小鼠的主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，记录主要脏器的值量，比较脏器指数，结果显示最大给药组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的脏器指数，与正常对照组比较，无统计学差异(P>0.05)。其结果见表3。

表1 对小鼠体质量变化的影响

表2 对小鼠血液生化学指标的检测结果

表3 对小鼠主要脏器指数的检测结果

2.2.4.5 对小鼠病理形态学的影响

肉眼仔细观察最大给药组和正常对照组小鼠被剥离的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要脏器，结果均未发现脏器萎缩、肿大、坏死等异常改变。对正常对照组和最大给药组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等做病理形态学检查，结果显示，各组小鼠均未出现由受试药物引起的中毒性的病理改变。

3 讨论

实验室前期在收集总结大量民间验方实例的基础上，首先就红树莓原液对免疫抑制机体的免疫调节作用进行了相关的实验研究，实验结果显示，红树莓原液可通过促进小鼠脾脏、胸腺等免疫器官的发育，起到上调免疫功能的作用[8-9]。通过升高血清IFN-γ、IL-4水平，降低IFN-γ/IL-4，调节Th1/Th2漂移，以及增加免疫抑制小鼠胸腺和脾脏指数，来达到对环磷酰胺免疫抑制模型小鼠的免疫调节作用[10]。为评价红树莓的安全性，本课题组对红树莓根茎水煎剂(RRD)在昆明小鼠体内的急性毒性实验进行了研究。

本研究结果表明，以最大浓度为5.56 g/mL、最大耐受容积为0.04 mL/g给小鼠1次灌胃，生药量为222.4 g/(kg·d)做预实验，即半数致死量(LD50)实验。红树莓根茎水煎剂组小鼠仅在给药当天精神状态、反射活动稍有减弱，20 min后恢复正常，可能和药物刺激有关。连续观察7 d未见实验小鼠中毒死亡或其他异常情况，说明红树莓根茎水煎剂(RRD)无明显急性毒性，无法检测半数致死量(LD50)。为评价红树莓根茎水煎剂的安全性进行了小鼠的最大给药量(MTD)实验，以最大浓度为5.56 g/mL、最大耐受容积为0.04 mL/g给小鼠灌胃每天2次，生药量为444.8 g/(kg·d)。最大给药量(MTD)实验结果显示，最大给药组小鼠在第二次灌胃后，出现精神萎靡、反射活动减弱、大便次数增加，2 h后恢复正常。连续观察7 d，最大给药组小鼠在精神状态、呼吸运动、行为活动、反射活动、饮水、进食、大小便等方面，与正常对照组相比，无明显差异(P>0.05)，观察期间无1例小鼠死亡。最大给药组小鼠体质量仅在灌胃后第1天较正常对照组明显减轻(P<0.05),第4天、第7天体质量增加与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。肉眼仔细观察正常对照组和最大给药组小鼠被剥离的主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等结果显示，各组小鼠均未发现脏器萎缩、肿大、坏死等异常改变，进一步对实验小鼠的主要脏器做病理形态学检查结果显示，各组小鼠均未出现由受试药物引起的中毒性的病理改变。血液生化学指标和脏器指数指标均无统计学意义(P>0.05)。

在药物急毒实验中，半数致死量(LD50)是一个重要的评价指标，其值越高，药物的可能毒性就越小，本动物实验未测出红树莓根茎水煎剂灌胃小鼠的半数致死量(LD50)，表明红树莓根茎水煎剂的毒性很低。最大给药量(MTD)实验是指一日内单次或多次(2～3次)以允许的最大给药剂量给药，在一定期间出现的毒副反应。本实验以最大浓度和最大耐受容积给小鼠灌胃，最大给药组小鼠和正常对照组小鼠均未观察到明显的毒性反应，整个实验过程中未见小鼠中毒死亡。在本次实验设计中，红树莓根茎水煎剂(RRD)对昆明小鼠的最大给药量为444.8 g/(kg·d)。

综上所述，通过红树莓根茎水煎剂对昆明小鼠的急性毒性实验，结果显示红树莓根茎水煎剂对昆明小鼠无明显的急性毒性作用，血液指标及脏器指标无异常，表明红树莓根茎水煎剂具有较高的安全性。

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