Rac1在血清中的表达与胃癌易感关系研究

（1青海大学附属医院 青海 西宁 810001）

（2青海省第五人民医院 青海 西宁 810001）

（3青海大学研究生院 青海 西宁 810001）

（4青海大学医学院 青海 西宁 810001）

Rac1作为小GTPases蛋白家族Rac亚家族的成员之一，其成员主要包括Rac1、Rac2、Rac3、Rac1b等，这些成员在组织中呈非特异分布，具有GTP结合活性，当与GTP结合时具有生物学活性，与GDP结合时活性丧失[1]。其活性调节的过程主要由鸟甘酸交换因子（GEF）、GTPases激活蛋白（GAPs）、鸟苷酸抑制因子（GDIs）所介导[2]。Rac1可促进肌动蛋白聚合，参与板状伪足、丝状伪足和黏着斑的形成调节细胞的迁移和黏附能力[3]。有研究表明Rac1在乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴细胞白血病等肿瘤中高表达[4]。Carolina E.等向结肠癌细胞sw620中分别转染过表达野生型Rac1的质粒和不表达Rac1的质粒，结果发现前者结肠癌细胞的表型明显恶化，而后者结肠癌细胞几乎停止增殖，提示Rac1与肿瘤的发生、发展有关[5]。Georgina A等使用Rac1抑制剂ZINC69391 处理恶性胶质瘤细胞发现，6h后细胞增殖能力减弱，出现明显的凋亡，24h后发生迁移的细胞数明显减少，提示Rac1在肿瘤中主要发挥促增殖、抗凋亡及促进肿瘤迁移的作用[6]。Rac1对肿瘤细胞凋亡的调节主要是通过调节细胞周期及细胞骨架的形成来实现的。Huang YS等应用RNA干扰技术或Rac1抑制剂降低结肠癌、乳腺癌细胞中Rac1表达后，均出现细胞凋亡率增加，G1期细胞数目增多，CyclinD1表达下调的现象[7-8]。Rac1对肿瘤迁移能力的调节与其对细胞骨架的影响密切相关。有研究结果显示，在肺癌细胞中转染ITSN-1后肺癌细胞的增殖受到抑制，同时多余的ITSN-1将通过Cbl E3泛素化酶使Eps8发生泛素化，抑制Eps8与mSos形成复合体而损伤Rac1，损伤后的Rac1在ITSN-1的作用下形成较细的肌动蛋白束和较小的黏着斑，进而抑制肺癌细胞的迁移[9]。此外，Rac1还可通过促进肿瘤血管形成促进肿瘤迁移。乳腺癌中活化的Rac1/cdc42降低p53的表达量，促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖，促进乳癌迁移。同时，Rac1/cdc42的活化可使p53发生泛素化降低其稳定性，促进血管的生成，进而促进乳癌的转移[10]。

青海是全国胃癌高发地区，其发病机制和涉及的相关细胞内信号途径一直未被阐明清晰，本研究通过对比胃癌患者和健康对照组之间Rac1在血清中的表达情况，了解其与胃癌易感关系，为胃癌的最终诊疗提供重要的实验依据。

1.资料及方法

1.1 研究对象

收集青海大学附属医院、青海省第五人民医院胃癌患者80例；青海大学附属医院体检中心收集健康体检者血清80例，作为对照组。全部患者及健康对照组一般资料差异对比，无统计学意（P＞0.05）。

1.2 实验设备与试剂

设备：iMax全波长酶标仪（伯乐，美国），台式冷冻离心机（Effendorf，德国），水浴锅（北京六一，中国），恒温培养箱（上海万恒，中国）。

试剂：人Rac 1 Elisa试剂盒（武汉依莱普利，中国）。

1.3 方法

1.3.1 血清分离 将收集的胃癌患者及健康体检者含抗凝剂的全血于4℃，以3000rpm/min离心8min，抽取上清约500μL于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3.2 标准品配置 将人Rac1试剂盒于室温下平衡30min，取出相应冻干标准品，以12000rpm/min在常温下离心10min，加入对应标准品稀释液1mL，轻轻摇动，于室温下放置10min，使标准品完全溶解，配置成已知浓度的标准品；并取8个灭菌1.5mL离心管编号1-8，向1号离心管中加入200μL已知标准品，其余各离心管中均加入100μL标准品稀释液，采用倍比稀释法将已知浓度标准品稀释2、4、8、16、32及64倍。

1.3.3 Elisa酶链标记反应检测 将配好的浓度梯度标准品从低浓度到高浓度依次上样于酶标板，同时抽取各血清标本100μL上样于酶标板，置于37℃恒温培养箱孵育90min。孵育结束后，于滤纸上将酶标孔中液体拍干，将酶结合物浓缩液按1:100比例稀释，以100μL加于各酶标孔中，混匀，37℃恒温培养箱中孵育60min。生物素化抗体浓缩液按1:100的比例稀释，以100μL的量加入各孔中，37℃孵育30min。待标准品颜色梯度出现后，向各孔中加入50μL反应终止液，于全波长酶标仪450nm处检测各孔吸光度。

1.4 统计学分析

统计分析采用SPSS19.0进行，数据以相对数表示，两两比较采用χ2检验，检验水准ɑ=0.05。

2.结果

2.1 胃癌患者血清Rac1表达水平

通过对胃癌和健康对照组血清Rac1表达情况的检测，结果显示，胃癌患者血清Rac1的阳性率为75%，而健康对照组血清Rac1的阳性率为33.75%，胃癌患者血清Rac1的阳性率显著高于健康体检者，两组相比具有统计学意义（P＜0.001）（表1）。

表1 胃癌患者和健康体检者血清Rac1阳性率

2.2 Rac1表达与患者临床病理特征关系

通过对患者临床病理特征资料与Rac1表达进行分析，发现Rac1在血清中的表达水平与患者性别、年龄无关（P＞0.05）。但是，Rac1表达在低分化胃癌和发生淋巴结转移的胃癌中较高，与高中分化胃癌组织、未发生淋巴结转移胃癌组织相比具有显著差异性（P＜0.05）（表2）。

表2 胃癌患者血清Rac1的阳性率与临床病理特征

3.讨论

Rac1是G蛋白家族成员之一，位于7号染色体，具有GTP激酶活性，可与GTP或GDP结合，当其与GTP结合时具有生物学活性，可参与应力纤维、黏着斑的形成，调节细胞骨架重塑、板状伪足及片状伪足的形成，维持细胞极性，进而调节细胞的迁移及增殖能力。有研究表明，Rac1在结肠癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤中高表达，且其在肿瘤中的表达量变化与肿瘤的迁移能力成正相关[11]。另有研究表明，Rac1可通过活化PAK1等下游分子激活LIMK1,后者与胃癌的分化、淋巴结转移、迁移、侵袭能力有关。

本研究结果显示，胃癌患者血清中Rac1的阳性率高于健康体检者，且低分化胃癌患者血清Rac1的阳性率高于高中分化胃癌患者，发生淋巴结转移胃癌患者血清Rac1阳性率高于未发生淋巴结转移者，而与患者的性别及年龄无关。提示血清Rac1的阳性率与胃癌的发生、转移及分化程度相关。

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