丹参多化学成分的UPLC-LTQ Orbitrap MS快速表征解析

张驰，张彩娟，邱敏懿，晋小雁，邵远洋，刘莉，王敏，卢彦冰，王春国*，王学勇*(.北京中医药大学，北京 0009；.贵阳德昌祥药业有限公司，贵州 贵阳 55000)

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，具有行气止痛，温肾散寒的功效[1]，有“一味丹参，功同四物”之誉。丹参主要分布于河北、山西、陕西、山东、河南、江苏、浙江、安徽、江西及湖南等地。现代药理研究表明丹参在心血管系统方面能够改善微循环，改善冠脉循环，在血液系统方面能够改善血液流变性，促进组织修复和再生，临床中丹参素在抗心肌梗死、抗动脉粥样硬化等方面具有确切疗效，丹参注射液可用于治疗冠心病、胸闷、心绞痛等疾病[2-7]，因此研究其相应的化学物质信息显得非常有意义。

近年来，UPLC-LTQ Orbitrap MS技术广泛应用于中药及复方多成分的鉴定，通过高效液相色谱分离，利用高分辨串联质谱精确的相对分子质量定性优势，全面而快速对中药化学成分进行准确鉴定。目前，丹参药材中的化学成分主要分为脂溶性成分和水溶性成分，其中脂溶性成分主要是丹参酮类(邻醌型和对醌型)。水溶性成分主要是丹酚酸类[8-13]。对于丹参药材的化学成分分析和质量控制，已经进行了大量研究，主要包括HPLC、HPLC-MS等分析手段[14-27]。LTQ Orbitrap MS是将线性离子阱质谱和高分辨质谱结合的杂交型质谱仪，具有多种组合扫描模式，可以提供多达10级的结构碎片信息和100 000以上的分辨率[28]。本研究运用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用技术系统分析了丹参中二萜类、酚酸类、醌类等化学成分，根据丹酚酸B、丹参酮IIA等标准品的碎片信息及质谱裂解规律进行快速筛查，并根据精确分子量及二级碎片信息分析共鉴定出70种化合物，进一步丰富和细化了丹参有效成分信息特征。本研究结果可为丹参化学成分的分析提供一定参考，为丹参药材品质及质量控制研究提供借鉴。

1 仪器与试剂

LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪(美国Thermo Scientific公司产品)，配有热喷雾离子源(HESI)、Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统(含二元梯度泵，自动进样器，柱温箱)、DAD检测器、Millipore Synergy UV型超纯水机(美国Millipore公司)、R200D型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；SY-601型超级恒温水浴(天津欧诺仪器仪表有限公司)、水为超纯水，甲醇、甲酸、乙腈均为质谱级。丹酚酸B(批号111562-200504,纯度≥98%)购买于中国食品药品检定研究院、丹参酮IIA(批号130602,纯度≥98%)购买于成都普菲德生物技术有限公司、原儿茶醛(批号110810-200506,纯度≥98%)购买于中国食品药品检定研究院、隐丹参酮(批号110852-200806,纯度≥98%)购买于中国食品药品检定研究院、二氢丹参酮I(批号13082317,纯度≥98%)购买于中国食品药品检定研究院。丹参药材经北京中医药大学王学勇教授鉴定其原植物为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)。

2 方法

2.1 标准品溶液配制

精确称取标准品丹酚酸B 5.4 mg，原儿茶醛5.2 mg，二氢丹参酮I 5.4 mg，隐丹参酮4.9 mg，丹参酮IIA 4.9 mg，用甲醇溶解，并在10 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，得标准品溶液浓度分别为丹酚酸B 0.54 mg·mL-1，原儿茶醛0.52 mg·mL-1，二氢丹参酮I 0.54 mg·mL-1，隐丹参酮0.49 mg·mL-1，丹参酮IIA 0.49 mg·mL-1。过0. 45 μm微孔滤膜，备用。

2.2 供试品溶液配制

取丹参干燥药材，进行粉碎，精密称取药材粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，进行超声提取30 min(功率：200 W；频率：40 kHz)，摇匀，溶液过滤，取上清。并经微孔滤膜(0.45 μm)过滤，作为供试品溶液备用。

2.3 色谱和质谱条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-Cl8柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈，色谱梯度洗脱，洗脱程序：0～1 min，4%B；1～2.5 min，4%～13%B；2.5～7.5 min，13%～22%B；7.5～8.5 min，22%～48%B；8.5～12 min，48%～60%B；12～13 min，60%～90%B；13～14 min，90%B。流速为0.4 mL/min，进样量2 μL，柱温为35℃。

2.3.2 质谱条件

HESI离子源，正、负离子检出模式，离子源温度350 ℃，电离源电压4 KV，毛细管电压：35 V，管透镜电压：110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气流速 40 arb，辅助气流速：20 arb；数据采用傅里叶变换高分辨全扫方式(TF，Full scan，Resolution 30000)数据依赖性(data-dependent acquisistion)ddMS2；母离子列表(Parent ion list)PIL-MS2。

2.4 数据处理

通过Xcalibur2.2和HighChem Mass frontier 7.0软件，根据目标化合物的相对分子量、同位素峰等信息判断化合物的元素组成，在总结对照品的碎裂信息及文献中相关信息并结合化合物的碎片信息，对相关化合物进行结构分析，并根据碎片裂解信息推测并鉴定相应的化合物。

3 结果

根据软件设定合适的阈值参数，对正、负离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物准离子分子峰信息，根据供试品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰、碎片离子等信息并结合相关文献，根据质谱提供的准确相对分子质量计算化合物的精确分子式，再依据高能碰撞下碎片离子信息推测化学成分。本文从丹参质谱正、负总离子图中(如图1和2)选择离子响应效果较明显的峰，并根据保留时间及相关文献数据进行对比，共鉴定出丹参类成分70种，其中二萜类成分有50种，包括对醌型二萜类、邻醌型二萜类及内酯型二萜类；酚酸类成分共鉴定出20种(结果见表1)。

3.1 二萜类成分解析

二萜类成分可分为邻醌型二萜类，对醌型二萜类以及内酯型二萜类。本实验共鉴定出二萜类成分50种。根据对照品丹参酮IIA的裂解碎片解析其裂解规律，在LTQ-Orbitrap MS中(R=30 000)，正离子模式下丹参酮IIA准分子离子峰为m/z 295.132 29[M+H]+，CID裂解后，在二级质谱图中出现碎片离子m/z 280、277、266、249、235、225、207、183等特征碎片离子。由图3可知碎片离子m/z 280、277主要是丹参酮IIA失去小分子甲基、水形成的；由于丹参酮IIA存在未芳化的A环，其容易失去一分子水，在二级谱图中主要显示出[M+H+18]+的质谱峰，同时碎片离子m/z 266是由母离子失去醛基形成的；碎片离子m/z 277失去小分子-CO可形成碎片离子m/z 249。根据碎片离子峰的特点，推断丹参酮IIA可能的裂解途径如图3和图4所示。

图1 丹参正离子总离子图

图2 丹参负离子总离子图

图3 正离子模式下丹参酮IIA的二级质谱图

图4 正离子模式下丹参酮IIA的质谱裂解途经

根据标准品丹参酮IIA的裂解规律及碎片离子特征，运用LTQ-Oribitrap MS软件对丹参药材中的化学成分进行数据采集，并结合高分辨质谱精确分子量进行鉴定。根据丹参酮IIA m/z 280、 m/z 277、m/z 249等特征碎片及化合物的结构特征，核对相应化合物的碎片裂解信息，对丹参中的二萜类成分进行快速筛查与定性鉴别(表1所示1～50)。

根据丹参质谱的总离子图进行解析，4号峰在负离子模式下的二级质谱图中有m/z 280、 m/z 277、m/z 249等同丹参酮IIA有相似的碎片离子，推测其可能是与丹参酮IIA有相似结构的化合物；根据其母离子m/z 295，且可以见到m/z 280的碎片离子，推测其可能是失去一分子甲基；碎片离子m/z 277可能是由于母离子失去一分子水获得；4号峰中m/z 266、m/z 265信号比较强烈，推测其可能更容易失去一分子醛基。结合丹参酮IIA及丹参酮VI的结构式发现丹参酮VI的结构中更容易失去一分子醛基，故而推测其为丹参酮VI(二级质谱图如图5)。

图5 丹参酮VI二级质谱图

10号化合物中准分子离子为m/z 277[M-H]-，同时也存在m/z 249、m/z 221、m/z 193等碎片离子， m/z 249的碎片是由基本母核失去一分子CO；m/z 221是由于碎片离子m/z 249丢失一分子CO，进一步丢失一分子CO碎片，形成碎片离子m/z 193。根据其与丹参酮IIA具有相似的碎片离子以及相对分子量，推测其与丹参酮IIA具有相似的基本母核，根据其裂解规律推断此化合物为次甲丹参醌(二级质谱图如图6)

图6 次甲丹参醌二级质谱图

表1 UPLC-LTQ Orbitrap MS鉴定丹参药材二萜类及酚酸类成分

续表1

*标记的为与标准品对照鉴定的化合物

3.2 酚酸类成分解析

酚酸类成分在负离子模式下有较好的离子响应。本研究从丹参的甲醇提取液中共鉴定出20种酚酸类成分。酚酸类成分在负离子模式下容易电离，根据酚酸类成分主要结构类型，判断其有失去-CO2、CO、H2O等中性碎片离子的特点，并根据酚酸类成分的基本母核及碎片信息进行相应化合物的推断。本实验共鉴定出酚酸类成分20种[30-31](表1所示51～70)。

根据对照品丹酚酸B在负离子模式下的碎片裂解信息推断其主要的裂解行为。对照品丹酚酸B的准分子离子是m/z 717.1450111[M-H]-，CID裂解后，得到碎片离子m/z 537、519、493、457、377、339、321、295等特征碎片离子，其中碎片离子m/z 537是由母离子发生酯键断裂失去C9H9O4得到的；m/z 493是由母离子失去C10H9O6得到；碎片离子m/z 519和m/z 321分别由分子离子峰失去C9H10O5和C9H10O5得到；分子离子峰m/z 339是由m/z 519失去C9H9O4得到的；m/z 295是由m/z339失去一分子-COOH得到的。根据碎片离子峰的特点，推断丹酚酸B可能的裂解途径如图7和8[29]。

图7 负离子模式下丹酚酸B的二级质谱图

图8 负离子模式下丹酚酸B的质谱裂解途经

38号化合物的二级质谱图的碎片离子主要有m/z 179、169、153、135、123、109、73，其质荷比为m/z 197，其中碎片离子m/z 179是由母离子失去一分子H2O得到的，进一步丢失一分子CO2得到碎片离子m/z 135；m/z 169是由母离子失去CO得到，进一步丢失-CH2O2得到碎片离子m/z 123；碎片离子m/z 153由分子离子峰失去一分子CO2得到。根据碎片离子峰的特点，推断丹参素可能的裂解途径如图9和10。

图9 正离子模式下丹参素的二级质谱图

图10 正离子模式下丹参素的质谱裂解途经

52号化合物的二级质谱图同标准品丹酚酸B的二级质谱图相似，均具有m/z 537、519、493、457、377等的碎片离子，且保留时间也与标准品一致，故而推断此化合物为丹酚酸B，其二级质谱图如图11所示。

57号化合物其相对分子质量为339，主要的碎片离子有m/z 321、m/z 295、m/z 280、m/z 185等。酚酸类成分极易失去CO、CO2、H2O，碎片离子m/z 321主要是由于母离子失去一分子H2O得到的；而m/z 295就是由m/z 339失去一分子-CO2得到的。根据其裂解方式及相对分子量推断出此化合物为丹酚酸G，其二级质谱图如图12所示。

图11 丹酚酸B二级质谱图

图12 丹酚酸G二级质谱图

4 讨论

本研究首次利用UPLC-LTQ Orbitrap MS技术对丹参中的化学成分进行快速定性鉴别，共鉴定出丹参中的化合物70种，其中二萜类成分50种，为丹参化学成分的定性鉴别提供了一个快捷、高效的方法。相比较于赵新峰[32]在丹参的HPLC-ESI-MSn分析中，共鉴定出15种丹参化合物，本研究共鉴定出70种丹参化合物；对于沈建芳[33]等利用HPLC-MS鉴定出丹参酮类的成分11种，夏光惠[34]等对民间丹参代用品荞麦地丹参进行定性分析，共鉴定出丹参中二萜类成分16种，本研究利用LC-MS技术鉴定出二萜类成分50种，极大丰富了丹参药材二萜类的化学指纹信息，为丹参后续研究与开发奠定了重要的分析化学基础。

本研究所发掘出丰富的丹参化学成分信息，不仅为快速解析不同来源丹参质量比较分析提供化学指纹具有重要意义，而且对于深入揭示“药材好、药才好”物质机制有重要价值。此外，该项目成果在深入揭示丹参次生代谢活动，解析丹参功能基因调控机制，揭示药材品质形成规律，丹参优良种质资源评价等方面，具有重要的学术意义和应用价值。

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