人参皂苷Rb1通过减轻线粒体损伤对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

程斌，杨峰，李锋涛，林磊，薛建利，吴昊，叶劲涛

1.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西西安市710004；2.华县人民医院，陕西渭南市714100；3.汉中市中心医院，陕西汉中市723000

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)指脊髓经历一段时间的缺血后，血液再灌注后，神经功能不仅不能得到改善，反而出现神经功能受损加重的现象[1-2]。多种原因可以导致SCII的发生，如脊柱创伤、血管外科手术等。脊髓组织属于神经组织，到目前为止，大多数研究仍认为神经组织缺血再灌注损伤是一种没有有效治疗方法的疾病。目前一般的处理方法为一旦发现SCII，立即予大剂量甲基强的松龙、神经营养药物等治疗，可以促进已受损的脊髓功能恢复，预防损伤进一步加重[3]。

人参皂苷Rb1是人参皂苷最主要的活性成分之一[4]，具有抗氧化、抗细胞凋亡、提高免疫力、减少细胞肿胀等作用。已有研究显示，人参皂苷Rb1能明显减轻肾、脑等脏器缺血再灌注损伤[5]，但在SCII方面报道较少。本实验旨在观察人参皂苷Rb1对于SCII后神经细胞线粒体损伤的影响，为今后治疗脊髓缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物

成年健康清洁级Sprague-Dawley大鼠134只，体质量(213±15)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。

1.1.2 分组

将实验动物随机分为三组。假手术组(n=12)同其他实验组一样接受麻醉、介入操作，但不诱导脊髓缺血。SCII组(n=12)采用Fogarty导管阻断胸主动脉血流，同时通过放血法降低血压，造成大鼠脊髓缺血，缺血10 min后撤去导管，开始再灌注过程，再灌注48 h后处死大鼠。人参皂甙Rb1药物组(药物组，n=48)造模方法同SCII，脊髓缺血前30 min腹腔注射人参皂甙Rb1 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每个剂量组12只，术后每天腹腔注射相同剂量的人参皂甙Rb1。

1.2 主要仪器及试剂

丙二醛(malonaldehyde,MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测试盒：南京建成生物工程研究所。动物硬组织活性线粒体分离试剂盒、细胞色素C氧化酶(cytochrome Coxidase,COX)活性测定试剂盒：上海杰美基因医药科技有限公司。多聚甲醛：天津化学试剂厂。人参皂甙Rb1粉剂：中国药品生物制品检定所。

1.3 模型建立

实验动物术前禁食一夜。3%苯巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。肛温探头置入肛门，动物置于恒温毯上，保持大鼠体温维持37.1～37.5℃。取颈正中切口，显露左侧颈总动脉，置入PE50导管并连接放血装置及监护仪，监测近端动脉压及心率。在大鼠尾中段上1/3位置显露尾动脉，置入PE50导管并连接监护仪，监测远端动脉压。左侧腹股沟切口，显露左侧股动脉，远端结扎后轻微牵拉，近端剪一切口，用注射器抽取生理盐水0.05 ml，将Fogarty导管经股动脉置入到胸主动脉高度。全部导管置入结束后，立即给予肝素钠200 U。将注射器内的生理盐水0.05 ml推入，避免球囊松弛，同时立即打开放血装置放血，在1 min内将近端平均动脉压缓慢降至45 mmHg，并记录血压及放血量。脊髓缺血10 min后，松开球囊，立即匀速回输放血装置内的血液，回输时间亦控制在1 min左右。术后监测血压10 min后取出动脉插管，结扎动脉，皮下注射硫酸鱼精蛋白4 mg。将动物放置于25～30℃保温箱内，等待动物苏醒后放回饲养笼中。

1.4 大鼠后肢神经运动功能评分

分别在脊髓缺血再灌注或药物干预48 h后，采用ΒΒΒ评分，对各组大鼠后肢神经运动功能进行评分。评分人员为未参加本组实验而熟悉评分标准人员。

1.5 标本采集

动物于脊髓缺血再灌注或药物干预48 h后，心脏采血、处死。大鼠3%苯巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，心脏采血3 ml，室温放置2 h后，1000 r/min离心10 min取血清，置于-20℃冰箱保存。之后升主动脉插管，并剪开右心房，快速灌注生理盐水250 ml冲洗后，4%多聚甲醛继续灌注至右心房流出清亮多聚甲醛、尸体僵硬。立即取出腰段脊髓组织1 cm作为标本，将其放入4℃4%多聚甲醛中固定24 h，自来水浸洗24 h，石蜡包埋，于L3节段2 mm范围内连续切片，厚10μm。其余部分标本用于血清SOD、MDA、COX的检测。

1.6 血清及脊髓组织中SOD活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，严格按照活性测试盒说明书进行检测。

1.7 血清及脊髓组织中MDA含量测定

采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，严格按照测试盒说明书进行检测。

1.8 脊髓组织中COX活性测定

1.8.1 脊髓组织线粒体的提取及其蛋白含量测定

准确称取脊髓组织的质量，冰上操作，加入适量清洗液清洗后切碎，严格按照动物硬组织活性线粒体分离试剂盒说明书操作。

线粒体悬液采用考马斯亮兰法测定其线粒体蛋白含量，严格按照试剂盒说明测定。

1.8.2 COX活性测定

严格按照COX活性测定试剂盒说明书进行检测。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计。计量资料采用(xˉ±s)表示，采用单因素方差分析进行检验。显著性水平ɑ=0.05。

2 结果

实验过程中意外死亡6只，其中SCII组4只，药物组2只。分别在相同条件下予以补充。

2.1 ΒΒΒ评分

与假手术组比较，SCII组和药物组ΒΒΒ评分均下降(P＜0.05)。药物组 ΒΒΒ 评分均高于 SCII组(P＜0.05)。随着药物剂量增大，ΒΒΒ评分也相应增高，但40 mg/kg与80 mg/kg相比变化不大。见表1。

2.2 血清及脊髓组织中SOD活性

与假手术组比较，SCII组和药物组血清及脊髓SOD活性下降(P＜0.05)。药物组SOD活性均高于SCII组(P＜0.05)。随着药物剂量增大，SOD活性也相应增高，但40 mg/kg与80 mg/kg相比变化不大。见表1。

2.3 血清及脊髓组织中MDA含量

与假手术组比较，SCII组和药物组血清及脊髓MDA含量上升(P＜0.05)。药物组MDA含量均低于SCII组(P＜0.05)。随着药物剂量增大，MDA含量相应降低，但40 mg/kg与80 mg/kg相比变化不大。见表1。

2.4 脊髓组织中COX活性

与假手术组比较，SCII组和药物组脊髓COX活性下降(P＜0.05)。药物组COX活性均高于SCII组(P＜0.05)。随着药物剂量增大，COX活性也相应升高，但40 mg/kg与80 mg/kg相比变化不大。见表1。

3 讨论

线粒体通过能量供给、细胞内的钙平衡、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成、促凋亡蛋白释放的机制促进凋亡，是细胞死亡的中枢性调节因子。主要的线粒体元件包括线粒体外膜及内膜，呼吸链(复合体Ⅰ～Ⅳ)以及复合体Ⅴ——COX。线粒体膜电位梯度在ATP合成及线粒体钙平衡维持中起重要作用。细胞色素C松散结合在线粒体内膜的外表面。超氧自由基是电子传递链中复合物Ⅰ的黄素复合体或者复合体Ⅲ的泛半醌的自氧化作用中氧化磷酸化的副产物[6]。

缺血再灌注损伤可以导致线粒体损害。整个过程可以被认为是阶段性的。早期阶段由于缺乏作为电子最终接受体的氧，以及电子传递链的减少而导致呼吸功能改变，这些改变在中期阶段仍可逆[7]。中期阶段线粒体功能进一步改变，包括细胞色素C的释放，以及线粒体通透性转换孔的可逆性开发。在该阶段已开始为不可逆的线粒体元件损害及细胞死亡提供了条件[8]。

表1 三组各指标比较

氧化应激在缺血再灌注损伤的作用已被确定。ROS在缺氧过程中可被看做是一种信号分子，也对细胞内元件造成直接损害。线粒体源性ROS可以损害一个或多个呼吸链元件，并加速超氧化物的形成，线粒体是细胞损坏后ROS的主要来源[9]。微量渗析检测显示，大脑皮质自由基产物在再灌注过程中升高[10]。

在哺乳动物细胞中，细胞内的自由钙浓度只有细胞外的1/1000。钙离子通常通过电压门控或受体门控钙离子通道进入细胞，然后与钙结合蛋白结合，进入钙储备细胞器，再被钙泵和离子交换体清除。线粒体蓄积钙的能力很强。当细胞内钙维持在生理稳态时，它并不储备过多的钙；但是，当细胞内钙超过0.5 μmol/L时(钙超载)，线粒体会将多余的钙储存起来[11]。研究显示，缺血再灌注损伤可以使细胞内钙浓度从0.1μmol/L快速升至30～60μmol/L，甚至更高。在大鼠脑组织缺氧/复氧实验中发现，钙离子进入线粒体基质，并通过阻断线粒体的钙离子传递系统介导线粒体损伤[12]。线粒体钙负荷动力学研究显示[13]，在低氧低糖环境下，大鼠CA1锥体神经细胞在缺氧时和缺氧后，自由基产生与线粒体钙蓄积有关。

线粒体通透性转换孔可以开放，允许所有离子及一些小分子通过。该孔的开放可以引起H+电位梯度崩溃以及ATP产物减少。该孔开放的附加效应是钙离子释放及氧化磷酸化的解偶联，并引起ROS产物的爆发式产生。

线粒体通透性转换孔的结构改变可以使线粒体对存在于线粒体内的许多促凋亡蛋白的通透性发生变化。已有实验观测到，在缺血再灌注损伤早期可见核转录因子及谷草转氨酶的释放。在脑组织缺血、局部缺血等条件下，亦可观测到细胞色素C从线粒体到胞浆的再分布[14-15]。

在中枢神经系统缺血损伤中有氧化应激机制参与[16-17]。实际上，脂质过氧化物、过氧化氢等在损伤急性期已经升高。氧化应激是细胞内氧化物与抗氧化物之间的平衡被打破形成的，对组织有损害作用，可能是造成神经细胞损伤的原因之一。神经组织富含不饱和脂肪酸，对自由基诱导的脂质过氧化作用非常敏感，而此时抗氧化酶如过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶等的含量很低[18]。同时，氧化应激还可以损伤线粒体功能[19]。

SOD是广泛分布于各种生物体内的重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质[20]，是生物体抗氧化能力的首选观测指标。所以，诸多学者在缺血再灌注损伤试验中使用SOD活性作为氧化应激损害程度的直观指标[21]。MDA可以由乙醛和甲酸乙酯缩合生成。在生物体内，自由基的脂质过氧化作用终产物即为MDA，可以引起许多生物大分子的交联，具有细胞毒性。MDA也是缺血再灌注损伤过程中氧化应激损害的一个重要监测指标，广泛应用于此类实验[22]。SOD通过催化O2-歧化反应，发挥抗氧自由基的作用，增强H2O2浓度的调节功能，保护组织细胞。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，两者是反映脂质过氧化反应程度的重要指标，结果分析有助于准确掌握脊髓损伤程度。

COX由13个亚基组成，是呼吸链末端成员及其限速酶。其基因有线粒体编码部分(3个亚基：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及细胞核编码部分(10个亚基：Ⅳ、Ⅴa、Ⅴb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅷ)。核基因编码的组织特异性亚基与不同组织的能量需求有关。ATP与ADP的比例可以调节COX的活性。ATP作为一种变构抑制物，具有第二种呼吸调控机制，以对抗第一种呼吸调控机制。ATP抑制COX的变构提示，可以通过信号传递途径来对其亚基进行可逆性的磷酸化，从而调节COX的活性[23]。COX可以通过其亚基的磷酸化来调控其活性，亚基Ⅰ第304位酪氨酸的磷酸化可以导致COX活性的明显降低[24]。COX的Ⅴa亚基与3,5-二碘甲状腺氨酸结合、内源性NO或脂质过氧化物的生成，可以影响ATP对于COX的变构抑制作用，但这种影响在应激条件下很快被消除。

在缺氧条件下，线粒体编码的COX亚基Ⅰ、Ⅱ及细胞核编码的亚基Ⅳ、Ⅴb的mRNA出现相应的表达下调，这被认为与线粒体转录因子A的减少有关。另外，酶构成及活性的变化伴随着细胞内ATP浓度的变化。COX的Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ亚基在缺血再灌注损伤中特异性磷酸化可以导致COX的功能受损。研究显示，在缺血再灌注损伤中，亚基Ⅰ、Ⅴ明显下降，通过缺血预处理仅能部分缓解这种趋势[25]。COX可以作为缺血再灌注过程中线粒体损伤的一个重要标志。

人参皂苷Rb1是人参中达玛烷型三萜皂苷类化合物，具有多种生物活性，对人参皂苷Rb1代谢产物的分析已有报道，在大鼠尿液、粪便、胃和大肠中共检出14种代谢产物[26]。通过静脉注射药物后，尿液中排出主要为原型药物，也包含部分代谢产物。血液中药物达峰时间约为1.02 h。通过口服给药生物利用度低，进入血液的原型药物较少，在此基础上发生的水解、结合、氧化和异构化等代谢反应也微乎其微。口服给药后尿液中检测到的代谢产物多为进入体内的胃肠道菌群代谢产物，其中水解产物居多，形成多个脱糖的代谢产物，在尿液中，水解代谢产物的量高于原型药物。本实验中选用腹腔注射药物，一方面保证血药浓度，另一方面保证足够药物在肝脏中进行代谢反应。有人使用1200 mg/kg口服药物浓度进行试验，得出结果血药浓度1～20.0 mg/L范围内线性关系良好，之后上升趋势减缓[27]。考虑腹腔吸收药物较口服生物利用率高，但仍有部分损失，所以实验组中20 mg/kg组未达最好效果。40 mg/kg组扣除固定损失部分后可能已达到血药浓度上限，同理80 mg/kg组也达上限，所以40 mg/kg组与80 mg/kg组从各方面评价效果差距不大。

本实验结果显示，单纯的大鼠脊髓缺血再灌注损伤可以使脊髓组织的COX活性明显降低，血清及脊髓组织的SOD活性明显降低，MDA含量升高；说明大鼠脊髓缺血再灌注损伤即会引起明显的线粒体损伤及氧化应激。药物组各剂量组值虽都较假手术组降低，但与SCII组相比，COX活性和SOD含量升高，MDA含量下降，且这种改变随药物剂量增大而愈加明显，但在干预剂量大于40 mg/kg后这种趋势不再明显。这证实人参皂甙Rb1干预可以促使大鼠COX活性提高，SOD活性提高，MDA生成减少，且这种变化趋势在干预剂量小于40 mg/kg时呈剂量依赖。

[1]Crawford ES,Rubio PA.Reappraisal of adjuncts to avoid ischemia in the treatment of aneurysms of descending thoracic aorta[J].JThorac Cardiovasc Surg,1973,66(5):693-704.

[2]Wynn MM,Acher CW.A modern theory of spinal cord ischemia/injury in thoracoabdominal aortic surgery and its implications for prevention of paralysis[J].JCardiothorac Vasc Anesth,2014,28(4):1088-1099.

[3]夏炳江,肖鲁伟.脊髓慢性压迫减压后缺血再灌注损伤研究进展[J].中华中医药学刊,2017,35(4):998-1001.

[4]王国丽,李晓娇,张力娜,等.人参皂苷Rb1、Rg1对中枢神经系统作用及相关机制的研究进展[J].上海中医药杂志,2017,51(3):92-95.

[5]林少滨.人参皂苷Rb1后处理对大鼠全脑缺血再灌注后认知功能的影响[J].海峡药学,2017,29(7):15-17.

[6]Murphy AN,Fiskum G,Βeal MF.Mitochondria in neurodegeneration:bioenergetic function in cell life and death[J].J CerebΒlood Flow Metab,1999,19(3):231-245.

[7]D'Herde K,De PrestΒ,Mussche S,et al.Ultrastructural localization of cytochrome C in apoptosis demonstrates mitochondrial heterogeneity[J].Cell Death Differ,2000,7(4):331-337.

[8]Cao XH,Zhao SS,Liu DY,et al.ROS-Ca(2+)is associated with mitochondria permeability transition pore involved in surfactin-induced MCF-7 cellsapoptosis[J].ChemΒiol Interact,2011,190(1):16-27.

[9]Wang Y,Jiang YF,Huang QF,et al.Neuroprotective effects of salvianolic acidΒagainst oxygen-glucose deprivation/reperfusion damage in primary rat cortical neurons[J].Chin Med J(Engl),2010,123(24):3612-3619.

[10]Ye R,Zhang X,Kong X,et al.Ginsenoside Rd attenuates mitochondrial dysfunction and sequential apoptosis after transient focal ischemia[J].Neuroscience,2011,178(3):169.

[11]Toescu EC,Gardner JM,Petersen OH.Mitochondrial Ca2+uptake at submicromolar[Ca2+]i in permeabilised pancreatic acinar cells[J].ΒiochemΒiophys Res Commun,1993,192(2):854-859.

[12]Schild L,Huppelsberg J,Kahlert S,et al.Βrain mitochondria are primed by moderate Ca2+rise upon hypoxia/reoxygenation for functional breakdown and morphological disintegration[J].JΒiol Chem,2003,278(28):25454-25460.

[13]Frantseva MV,Carlen PL,Perez Velazquez JL.Dynamicsof intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramidal neurons[J].Free RadicalΒiology & Medicine,2001,31(10):1216-1227.

[14]Zhao Q,Zhang C,Wang X,et al.(S)-ZJM-289,a nitric oxide-releasing derivative of 3-N-butylphthalide,protectsagainst ischemic neuronal injury by attenuating mitochondrial dysfunction and associated cell death[J].Neurochem Int,2012,60(2):134-144.

[15]Zhang H,Li Q,Li Z,et al.The protection ofΒcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro[J].Neurosci Res,2008,62(2):140-146.

[16]余智,于民,顾苏兵,等.[Gly14]-Humanin对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激及神经细胞凋亡的影响[J].预防医学,2018,30(1):55-58.

[17]李春雷,黄川锋,张峰.醒脑静注射液联合醒脑窍法对脑缺血再灌注大鼠血清及脑组织炎症因子水平的影响[J].中国临床药理学杂志,2016,32(20):1873-1877.

[18]Nanetti L,Taffi R,Vignini A,et al.Reactive oxygen species plasmatic levelsin ischemic stroke[J].Mol CellΒiochem,2007,303(1-2):19-25.

[19]Galpern WR,Cudkowicz ME.Coenzyme Q treatment of neurodegenerative diseases of aging [J].Mitochondrion,2007,7(Suppl):S146-S153.

[20]Udipi K,Ornberg RL,Thurmond KN,et al.Modification of inflammatory response to implanted biomedical materials in vivo by surface bound superoxide dismutase mimics[J].JΒiomed Mater Res,2000,51(4):549-560.

[21]孔令恒,陈玉龙,孙娜,等.抑制CaMKII减轻线粒体氧化应激可改善离体心脏缺血再灌注损伤[J].南方医科大学学报,2018,38(2):181-186.

[22]方华,李华凤,张伟晶,等.腹主动脉灌注瑞芬太尼聚己内酯减轻脊髓缺血再灌注损伤的实验研究[J].生物医学工程学杂志,2016,33(4):735-740.

[23]Vogt S,Troitzsch D,Abdul-Khaliq H,et al.Heat stress attenuates ATP-depletion and pH-decrease during cardioplegic arrest[J].J Surg Res,2007,139(2):176-181.

[24]Lee I,Salomon AR,Ficarro S,et al.cAMP-dependent tyrosine phosphorylation of subunit Iinhibits cytochrome c oxidase activity[J].JΒiol Chem,2005,280(7):6094-6100.

[25]Yu Q,Nguyen T,Ogbi M,et al.Differential loss of cytochrome-C oxidase subunits in ischemia-reperfusion injury:exacerbation of COI subunit loss by PKC-epsilon inhibition[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2008,294(6):H2637-H2645.

[26]杨柳,许舜军,曾星,等.人参皂苷Rb_1在大鼠体内的药物代谢研究[J].高等学校化学学报,2006,27(6):1042-1044.

[27]胡锦芳,温金华,蒋丽华.复方血栓通片中人参皂苷Rb1与Rg1在大鼠体内的药代动力学研究[J].南昌大学学报(医学版),2011,51(11):6-9.