降钙素原量子点荧光免疫层析检测法的方法学评价

钟阳青，陈锐，张伟龙，潘理想，陈杰，林燕珍

(东莞市塘厦医院检验科，广东 东莞 523722)

降钙素原（PCT）是一种内源性非类固醇抗炎物质，是降钙素的前体，在甲状腺中合成，在细菌感染时诱导产生，目前被认为在调控细胞因子的网络中发挥着举足轻重的作用[1]。PCT是全身感染、局部感染及预后判断的良好指标[2－4]。用于PCT检测的方法主要有免疫层析法[5]免疫比浊法[6]、上转荧光法、胶体金比色法、乳胶增强免疫比浊法、电化学发光法[7]和免疫色谱检测法。量子点(Quantum dots，QDs)，属于新型半导体纳米材料，具有优良的光谱特征和光化学稳定性。与生物荧光染料相比，其激发谱线范围宽、发射谱线窄、发光效率高、发光颜色可调、光稳定性好，十分适合作为荧光标记物[8]。本研究通过对量子点荧光免疫层析法的精密度、分析测量范围、生物参考区间及与梅里埃miniVIDAS荧光免疫法的比对试验来评价其方法学性能，现报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料 梅里埃miniVIDAS免疫荧光检测系统（参比系统），深圳金准生物量子点荧光免疫检测系统（实验系统），配套的校准品、质控品，接近厂家声明分析上、下限的新鲜血清标本，收集2017年5月至2017年6月东莞市塘厦医院检测的患者新鲜血清120例，其检测结果分布厂家说明的整个分析测量范围。

1.2 方法 精密度评价采用EP15－A3方案，即使用参比系统配套的两个浓度水平的质控品在实验系统上每天检测一批，每批重复测试5次，连续测试5d，通过统计计算重复性精密度和期间精密度；分析测量范围评价采用EP6－A2方案，即选择接近说明书分析测量上限（H）和下限（L）的标本，按照5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L 的比例混合，上机检测，每一份混合样品检测两次，以理论值为纵坐标、实测值为横坐标，计算斜率、截距和线性相关系数；生物参考区间验证采用C28－A2方案，选取于体检科体检的健康个体血清20例，上机检测，所有20例标本中有大于95%的标本检测结果小于0.25ng/ml为可接受；对比实验用新鲜血清2h内分别在参比系统和实验系统上进行检测。

1.4 仪器试剂 梅里埃公司miniVIDAS分析仪；深圳金准生物有限公司PCT测定试剂盒；所有仪器均使用配套试剂，严格按照厂家要求进行维护保养，各检测系统实验期间质控均在控。

1.5 统计方法 实验数据收集完成后录入excel表格，采用SPSS 19.0进行统计分析。以参比系统结果为准，以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml为临界值，计算实验系统的阳性符合率、阴性符合率、假阳性率、假阴性率、诊断符合率，率的比较使用χ2检验，P＜0.05为有统计学差异；通过Kappa分析法分析三种检测方法的一致性，K值大于0.75为一致性较好，K 值在 0.4～0.75 之间表示一致性一般，kappa＜0.4 为一致性较差。

2 结果

2.1 精密度评价结果 在2.01ng/ml浓度水平时重复性精密度 CV为 4.96%，期间精密度 CV为6.81%， 在 20.13ng/ml浓度水平时重复性精密度CV为4.70%，期间精密度CV为9.68%。 见表1。

表1 精密度评价结果

2.2 分析测量范围评价结果 采用EP6－A2文件的要求进行实验及统计分析，低值标本测定均值为0.1327ng/ml，高值标本均值为 93.2917ng/ml，通过线性回归分析后斜率 a=0.978， 截距 b=－0.741，线性相关系数 r=0.996， 斜率 a 在 0.97～1.03 之间，线性相关系数 r＞0.975， 检测系统在 0.1327ng/ml～93.2917ng/ml浓度范围内呈线性。

2.3 诊断效能评价结果 以参比系统为准分别取0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml为临界值， 统计实验系统的阳性符合率、阴性符合率、假阳性率、假阴性率、诊断符合率，结果见表2、表3。

2.4 生物参考区间验证 选取的20份健康体检者的血清标本PCT检测结果均小于0.25ng/ml；

2.5 与参比系统结果一致性分析 当K值＞0.75时表示一致性较好，介于0.4～0.75之间时一致性一般，当K值＜0.4时表明两种方法的一致性较差。以0.25ng/ml为临界值时 K 值为 0.73， 以 0.5ng/ml为临界值时K值为0.81，以2.0为临界值时K值为0.95。

2.5 与参比系统结果的相关性分析 选取的120份标本浓度范围在 0.05ng/ml到 59.88ng/ml之间，在2h内完成两检测系统的检测。结果通过线性回归分析得出斜率 a 为 0.865，截距 b 为 0.294，相关系数R2为0.982，相关性较好。

表2 不同临界值下的检测结果（例数）

表3 不同cut-off值下量子点免疫荧光层析法的诊断效能（%）

图1 参比系统与实验系统检测结果相关性分析

3 讨论

血清降钙素原（PCT）是反应全身炎症状况的生物标志物，具有实时、便捷、敏感、特异等优点，随着研究的深入、检测技术的进步，大量研究表明以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml为临界值其在 AECOPD、浓度血症等的辅助诊断、预后判断和指导抗生素使用方面有重要的意义[9－11]。因此对PCT的检测结果准确度和灵敏度要求较高。

量子点(Quantum dots，QDs)，属于新型半导体纳米材料，具有优良的光谱特征和光化学稳定性。与生物荧光染料相比，其激发谱线范围宽、发射谱线窄、发光效率高、发光颜色可调、光稳定性好，十分适合作为荧光标记物[8]。何国炜[12]等的研究表明量子点荧光免疫层析法检测PCT的性能与Roche电化学发光系统的检测性能有很好的相关性。余皓[13]等的研究也表明量子点技术与其它免疫定量检测具有较好的可比性。

本研究采用EP15－A3文件[14]方案对量子点荧光免疫层析法（试验系统）进行精密度评价，结果在 2.01ng/ml和 20.13ng/ml浓度时其重复性变异系数（CV）分别为 4.96%、4.70%，期间变异系数（CV）分别为6.81%，9.68%，厂家说明书给出批内CV＜15%，批间CV＜20%，验证结果符合厂家说明，根据国家卫生与计生委员会临床检验中心室间比对允许总误差为30%，重复性CV小于1/4允许总误差，期间精密度小于1/3允许总误差，表明其精密度符合要求。分析测量范围评价采用EP6－A2文件[15]方案进行，结果在厂家声明的整个线性范围内结果呈线性；选取的20例健康个体的血清标本其PCT检测结果均小于 0.25ng/ml；

实验系统与参比系统的检测结果比较在以0.5ng/ml和 2.0ng/ml为临界值时两种方法的诊断符合率分别为90.83%、98.33%，一致性较好K值分别为 0.81 和 0.95，但是在以 0.25ng/ml为临界值时一致性一般K值为0.73，存在着25%的假阳性率，但是其阳性符合率达98.333%，总的诊断符合率达86.67%，故符合临床检测的需要。

随着检测技术的进步和临床研究的深入，PCT检测在全身感染和局部感染的诊断和鉴别诊断、治疗方案选择、预后判断等方面起重要作用[16]。本研究表明三种检测系统间比较各有优劣，检测结果两两比较相关性均较好，但是结果数值差异较大，因此实验室检测同一病人的标本需要固定检测系统，或进行检测系统之间的相关性转换，保证科室结果的一致性。

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