黑茶真菌污染研究进展及探讨

姜依何，胥伟，朱旗*

1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128

真菌毒素（Mycotoxins）是由真菌（Fungi）产生的一类具有细胞、器官或机体毒性的次生代谢产物，广泛存在于食品和饲料中，主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉素、伏马毒素、单端孢霉烯族毒素等种类[1-4]。真菌毒素的研究范围集中于产毒菌株的确证[5]、生物合成通路的解析[6]、产毒条件的研究[7]、暴露值的评估[8]、生物毒理性影响[9]、共轭型隐蔽毒素的分析[10]、检测技术的建立[11-13]、脱毒（或解毒）材料的筛选和方法的建立[14]等，为降低食品风险、减少危害提供理论及技术支持，在保障食品安全方面具有重要意义。

近年来随着消费者对纯天然饮品需求量的增加及茶叶保健功效的不断深入研究，特别是在减肥降脂[15]、调理代谢[16]等方面生物活性的科学确证，使得全球范围内茶叶消费量得到不断提高。在茶叶加工过程中，以微生物胞外酶催化为主导作用促进品质转化形成其特有品质风格的茶类为黑茶。现有黑茶微生物的研究已明确曲霉属真菌（2013年，散囊菌属的部分菌株已移入曲霉属，冠突散囊菌即在此列[17]）为黑茶发酵过程中的优势菌群[18-20]。而从食品安全的角度考虑，曲霉属（Aspergillus）真菌可产生多种真菌毒素，如：黄曲霉毒素（Aflatoxins）[21]、赭曲霉素（Ochratoxins）[4]、橘霉素（Citrinin）[21-22]、环匹阿尼酸（Cyclopiazonic acid）[23]、棒曲霉素（Patulin）[24]、青霉酸（Penicillic acid）[25]等。由于黑茶可长期储存的特性，从贮存的角度考虑，有研究表明该阶段有青霉属（Penicillium）真菌存在[26-27]，青霉属真菌亦可产生多种真菌毒素，除上述真菌毒素之外[28]，还存在如下数种：娄地青霉素C（Roquefortine C）[29]、PR毒素（PR-toxin）[4]等。

在已有的研究中，虽无直接研究成果证明黑茶的真菌毒素暴露水平对消费者产生了毒理性影响，但部分学者已经报道了黑茶真菌毒素方面的研究成果。特别是近期针对真菌污染黑茶可能产生的有害微生物及其毒素争论较激烈，如何客观的认识该问题，本文介绍了几种已在黑茶样本中研究的真菌毒素类型、形成的条件及检测方法，以期为食品安全政策制定者和科研人员提供参考。

1 黄曲霉毒素（Aflatoxins）

1.1 黄曲霉毒素概况

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉（Aspergillusflavus，产毒菌株占 40%~50%[30]）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，产毒菌株约占90%[30]）产生的具有生物毒性的次生代谢产物[31]。依据结构的不同，黄曲霉素又分为 B1、B2、G1、G2、M1、M2等数种类型，其中以 AFB1（Aflatoxin B1, AFB1）的毒性最大[32]，其生物合成通路见图 1，AFM1和 AFM2是哺乳动物摄入黄曲霉素后在动物体内转化生成的一类物质[33]。不像寄生曲霉鲜见于东南亚，黄曲霉分布广泛[30]，因此，黑茶中黄曲霉素的研究主要针对黄曲霉污染后在黑茶上的生长及生物合成。

1.2 黄曲霉外源污染黑茶基质

在现有的黑茶微生物群落组成研究中，暂未发现有黄曲霉的报道[34]。但从外源接种的角度来讲，茶叶样本如若经过潮水使得茶叶含水量达到渥堆水平时，黄曲霉存在在该基质上生长的可能[35-36]；如若仅接种而不潮水，黄曲霉则无法在该基质生长[35]。这表明，茶叶样本含水量是黄曲霉是否在茶叶基质上生长的关键因子，但添加黑茶水浸出物（有研究直接添加茶多酚[37]）的培养基能显著地抑制黄曲霉在平板上的生长[38]。在对茶叶生产环境中的真菌多样性进行研究发现茶叶加工空气中有黄曲霉菌株的存在[39]，表明在黑茶生产的过程中存在黄曲霉菌污染的可能。从黑茶等温吸湿模型可以看出[40]，在允许的时间范围内，空气湿度直接决定了仓储期的黑茶平衡含水率，从理论上来讲，黄曲霉在高湿条件下便有侵染黑茶基质的可能。

1.3 黄曲霉外源污染黑茶的毒素暴露水平

出于黑茶发酵过程真菌体系复杂的考虑，多种真菌毒素检测技术应用到了黑茶样本中。虽然有研究报道了黑茶中存在黄曲霉毒素的可能[11,41-46]，但检出阳性结果的方法多来自于酶联免疫检测法，由于茶叶中含有大量的多酚类物质、黑茶中的茶色素以及其他干扰物质，使得该种检测方法在检测真菌毒素的测试中被广泛地认定存在假阳性结果的可能[47]，测试技术发展到如今，该方法已被淘汰，其阳性结果也需要进行色谱确证。目前使用高效液相色谱联用串联质谱法检测茶叶样品中黄曲霉毒素有选择性好、且得到的试验结果准确的优点，已逐渐取代传统的液相色谱方法[48]。使用上述两种检测方法研究黑茶样品中黄曲霉毒素的结果也有报道，刘妍等[44]采用高效液相色谱串联质谱的方法检测了 10份普洱茶样，其中有两份检出 AFB1，含量分别为 3.1 ng·g-1和 7.5 ng·g-1。吴静等[49]采用IAC-HPLC的方法检测了60份普洱茶样品，AFB1含量范围在 0.236~8.452 ng·g-1，88.3%的样 品 低 于 5 ng·g-1。 Doris Haas[26]、 Sofie Monbaliu[50]和 B. Romagnoli[51]则均未检出黄曲霉毒素。上述结果表明，黄曲霉毒素并非广泛存在于黑茶样品中，而存在黄曲霉毒素阳性结果的黑茶样品中含量亦远低于日本报道的20世纪90年代日常植物性食物黄曲霉毒素的含量（10~4 918 ng·g-1）[52]，由于黄曲霉毒素难溶于水，黄曲霉毒素从茶叶到茶汤的转移率也是极低的。因此，黑茶的黄曲霉素暴露处于较低水平，黄曲霉毒素污染所导致的食品安全风险极低。

图1 黄曲霉毒素生物合成通路示意图Fig. 1 The diagram of biosynthesis pathway of aflatoxins

1.4 茶叶基质对黄曲霉素合成途径的影响

茶叶基质成分具有很强的特殊性和复杂性，内含有丰富的咖啡碱、茶色素、多酚类等物质，这些成分是茶叶具有健康功效的物质基础[53]，在外源污染真菌侵染的情况下，此类次生代谢产物同时具有抑制或制止霉菌产生真菌毒素的能力。李亚莉等[54]通过接种外源产毒黄曲霉于普洱茶基质上，并在高温高湿条件下培养和仓储，在一定的陈化期后进行样品检测，结果发现，具有产毒能力的黄曲霉在普洱茶基质上未产生黄曲霉毒素。这表明，黑茶基质中的某些成分具有抑制黄曲霉毒素合成的能力。H.Z.Mo等[55]和吴清华[56]通过半定量PCR技术研究了普洱茶对黄曲霉毒素合成过程的影响，结果表明，普洱茶基质能通过下调转录黄曲霉毒素基因家族的AflS和AflR来减少黄曲霉毒素的生物合成，AflS和AflR通过转录和翻译表达酯键水解酶（Est A），该酶是黄曲霉毒素合成过程的限速酶，该酶的表达减量抑制了VHA甲氧基酯键的水解形成VAL的过程，但下调表达相关基因的分子机理未得到明确阐述。张浩等[57]认为茶叶中多酚类物质槲皮素是抑制黄曲霉生长和产毒的活性因子，该物质通过激活抗氧化系统转录因子Yap 1诱导下调表达AflS和AflR基因。普洱茶不仅具有抑制黄曲霉产生毒素的能力，而且在普洱茶抗突变的研究中显示，普洱茶水提物甚至具有拮抗黄曲霉毒素诱导突变的能力[58]。

2 赭曲霉素（Ochratoxins）

2.1 赭曲霉素概况

赭曲霉素最初发现由赭曲霉代谢产生[59]，后研究表明是一类由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌[60]产生的具有致畸、致癌、免疫抑制、肝脏毒性及严重肾毒性的次生代谢产物[61-62]。现国际癌症机构认定其为2B类致癌物[63]，依据结构的不同，赭曲霉素又分为A、B、α、β等数种类型，其中以Ochratoxin A（Ochratoxin A, OTA）的毒性最大[64-65]，其化学结构式及生物合成途径[60]见图2。

2.2 黑茶赭曲霉素暴露水平

不像黄曲霉鲜见于黑茶基质，曲霉属真菌和青霉属真菌在黑茶微生物研究中被广泛检出[34,66]，部分研究论文明确报道了黑茶基质中赭曲霉的存在[67]，并检测了赭曲霉素含量为 1.8 ng·g-1。刘妍等[45]采用高效液相色谱串联质谱技术从10份黑茶样本中检出1份含有赭曲霉素，含量为 4.2 ng·g-1。Sofie Monbaliu等[41]则报道了茶叶中的赭曲霉素含量范围为2~10 ng·g-1，冲泡后的茶汤中的含量范围为0.5~2 ng·mL-1。Doris Haas 等[26]从 36 份普洱茶样品中检出了4份样本含赭曲霉素，含量分别为 0.65、0.65、14.8、94.7 ng·g-1，并认为黑茶样本中含量最高的OTA可能由样本中青霉属真菌代谢产生。莫瑾等[68]采用高效液相色谱串联质谱技术检测了19份普洱茶样品，结果均未检出 OTA。J.M. Mogensen等[19]采用HPLC方法检测的市售的普洱茶和红茶样本，结果亦均未检出 OTA。上述结果表明，OTA并非广泛存在于黑茶样品中，检出阳性样本的OTA含量在0.5~94.7 ng·g-1，这与外源污染真菌的种类有着直接的联系。黑茶中赭曲霉素相关研究较少，可能与其毒素等级有关。由于赭曲霉素来源广泛，且曲霉素和青霉属真菌是其主要的来源，而此类真菌与黑茶品质形成有着密不可分的联系。因此，赭曲霉素在黑茶中存在的状态值得进一步关注。

3 呕吐毒素（Deoxynivalenol）

3.1 呕吐毒素概况

呕吐毒素，学名：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生[69]的一类能够引起动物或人类呕吐、腹泻甚至肠道坏死的次生代谢产物，欧盟将其定义为三级致癌物[70]，其化学结构式及生物合成途径[71]见图3。

图2 赭曲霉素结构式及生物合成途径Fig. 2 Constitutional formula and biosynthetic pathway of ochratoxins

3.2 呕吐毒素在黑茶样品中的暴露水平

不像曲霉属真菌和青霉属真菌在黑茶中广泛存在，镰刀菌属真菌在黑茶微生物多样性研究中较少检出，仅赵仁亮报道了镰刀菌的产生[72]，陈建玲等[43]采用酶联免疫的方法对广州市场上的 70份普洱茶样本进行了 DON含量的检测，其含量范围为357~3107 ng·g-1，其中超过 1 000 ng·g-1的样本有 63份。吴静[49]采用酶联免疫的方法对60份普洱茶样本进行了DON含量的检测，其含量范围为347~3 005 ng·g-1，其中超过 1 000 ng·g-1的样本有 41 份。如前文所述，酶联免疫在黑茶样本中由于多酚类物质及其他次生代谢产物的干扰，假阳性结果存在普遍性，结果仅能做为初筛结果，需进行色谱确证。刘妍等[73]基于此，开发了针对黑茶样本的高效液相色谱串联质谱的方法检测了黑茶样本，结果发现在所检的 61份黑茶样品中，呕吐毒素检出3份，检出率为4.9%，其含量分别为 8.6、70.1、299.5 ng·g-1，色谱数据所检出结果低于国家标准 GB 2761—2017[74]中对谷物及制品的限量要求1 000 ng·g-1，表明黑茶中DON的暴露水平值低。由于黑茶中真菌毒素研究的相关报道较少，而呕吐毒素又在黑茶中有检出，因此相关研究是今后黑茶食品安全研究的方向之一。

图3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇结构式及生物合成途径Fig. 3 Constitutional formula and biosynthetic pathway of Deoxynivalenol（DON）

4 讨论与展望

我国黑茶生产体系中真菌多样性丰富，种类复杂的微生物在它们的共同作用下形成了不同地域不同风格的黑茶类产品。但由于黑茶产品从原料存放、生产加工、产品储藏、物流运输、商品贮存到最后的消费需要经历一个漫长的过程，如在不规范生产或贮存的情况下，黑茶产品存在产毒真菌菌株污染并产生真菌毒素的可能。本文通过对黑茶类产品真菌毒素的研究成果进行归纳总结，提示了不规范的生产方式和消费方式可能存在的安全风险，以期为企业生产和消费者饮用提供参考。

黑茶的生产与饮用历经千年，还未曾报道过流行病学显示的黑茶产品的安全性风险。虽然我们在现有的研究手段下，检测到非规范生产或贮存下的产品存在污染真菌菌株在黑茶基质上生长的现象，也检测出存在有真菌毒素的可能，表明标准化和规范化生产黑茶是非常必要的，生产贮存全过程应严格按照行业标准及国家标准进行[75-76]。

原料存放：由于黑茶原料的存放比较粗放，使用包装材料没有严格要求，但作为食品加工，黑茶包装应严格使用专用食品包装袋，忌用其他用途的包装袋，特别是采用旧饲料包装袋或粮油种子包装袋打包黑茶原料的做法，以防止有害微生物的交叉污染；同时，仓库管理上要留意气温和湿度的变化，防止原料在存放过程中发生霉变。

生产加工：要设定安全的渥堆场地，严格控制生产技术参数。把握好渥堆原料的大小，茶叶含水量的高低，渥堆时间等因素从而促进有益微生物的生长，抑制有害菌的生长；不能有急功近利、唯利是图的思想，采用不合理的生产方式，如高含水量和短时渥堆等错误方式，以免有害微生物滋生，影响产品的安全性；茯砖茶的发花工艺要严格控制好初始含水量及烘焙过程中的烘房内的温湿度等参数，时刻抽检在制品的发花进程，保证有益微生物的正常生长和培育。

产品贮存：黑茶产品通过陈放可改善其滋味，提高品质，但一定要避免不规范的湿仓做老，加水做陈等影响品质安全性的方式。实际上，高湿条件的产品贮存不但无法提高产品品质，相反极易造成受有害微生物的侵染，滋生多种有害霉菌[77]，导致茶叶品质劣变，甚至不能饮用。消费者自藏黑茶产品要严格保证存放条件，忌水、忌潮、忌异味。

另外，相关研究结果表明，黑茶多种品质成分具有抑制菌株生长或产毒的能力，而且已知的真菌毒素多为不溶于水或微溶于水的次生代谢物，对于只饮茶汤不食茶叶的消费方式来说，更加确保了黑茶产品饮用的安全性。因此，良好的生产规范和合理的贮存方式是黑茶安全生产的前提，根据黑茶加工技术国家标准，真菌污染是可以避免的，消费者通过正规渠道购买正规厂家生产的产品是安全的。

虽然黑茶类产品因污染真菌而导致的安全风险极低，但不规范的生产和储运方式仍存在增加黑茶产品感染污染真菌的风险。国际上对发酵类食品的微生物菌种管理非常严格，如美国的GRAS（Generally recognized as safe）评价体系和欧洲的QPS（Qualified presumption of safety）评价体系对食品用菌种的名单列表、审批程序、安全性评估、合理使用和监管都有严格的规定[78-86]。参照发酵食品加工的管理和监控经验，完善黑茶生产过程中的检测和检验手段及方法，应是今后黑茶产业发展要加强的方面。同时，现代发酵食品生产理念要求对食品中存在的微生物要明确其菌种信息并清晰其在食品加工过程中所发挥的作用。因此，精确解析黑茶加工过程中有害微生物的产生条件和有毒菌株的产毒可能性，在此基础上，根据食品工程的加工原理，严格筛选可用于黑茶发酵生产的有益菌种，实现黑茶加工精准定向发酵技术的应用和推广也应是黑茶生产努力的方向。

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