响应面法优化夏至草总黄酮的提取工艺△

段建荣

(张家口市沙岭子医院 药剂科，河北 张家口 07500)

夏至草为唇形科夏至草属植物夏至草的全草，又名小益母草、白花益母草、白花夏枯草等，广泛分布于华北、东北、西南、西北等地区。《本草纲目》中记载的茺蔚白花者应是夏至草，可活血去瘀、调经、降气逆、平肝潜阳，用于月经不调、半身不遂、血滞经闭、贫血性头昏等疾病。现代研究表明，夏至草醇提物能明显减轻Dextran 500所致AMD大鼠肠系膜血液及淋巴微循环障碍[1]；能明显降低dextran 500致AMD大鼠的血小板聚集与粘附功能、减少血栓形成[2]；能通过降低NO的生成和释放，减轻大鼠重症失血性休克后器官损伤[3]；可改善血瘀大鼠的血液流变性异常，提高器官血液灌流，具有良好的活血化瘀作用[4]；能明显降低Dextran 500致AMD大鼠的全血粘度和血浆粘度，提高红细胞变形能力[5]；能明显减轻Dextran 500致急性微循环障碍大鼠各器官功能障碍与组织学损伤[6]。有文献报道夏至草中含有多种黄酮类物质[7]，但未见有对夏至草总黄酮含量测定的研究。本文采用响应面法对夏至草总黄酮的提取工艺进行研究，为进一步研究开发夏至草提供实验基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

夏至草采自河北省张家口市万全区，由张家口学院韩博副教授鉴定为夏至草Lagopsissupina正品；芦丁对照品(北京盛世康普化工技术研究院FWYP-153-18-4)；其他试剂均为国产分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 仪器

T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Sartorius万分之一精密电子天平(德国赛多利斯天平公司)。

2 方法与结果

2.1 夏至草总黄酮的提取

将干燥的夏至草粉碎后过20目筛，60 ℃干燥至恒重。精密称取夏至草粉末10 g，选用不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，在单因素分析的基础上，采用Box-Behnken设计方案，选用不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，选取以乙醇浓度、料液比、提取温度为考察因素，超声辅助提取10 min，过滤，定容至100 mL。在提取工艺研究中改变相应参数。

2.2 检测波长的确定

精密称取芦丁标准品0.005 0 g，用60%的乙醇溶液溶解并定容至50 mL的棕色容量瓶中，配成0.1 mg·mL-1的对照品溶液。吸取对照品溶液适量，按照2.3项下方法显色，并于400～700 nm进行扫描，测定吸光度，结果显示，对照品溶液在510 nm处均有最大吸收，确定检测波长为510 nm。扫描图见图1。

图1 芦丁溶液吸收光谱

2.3 夏至草总黄酮的含量测定

精密吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL的芦丁对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，分别加60%的乙醇溶液适量至3 mL，各加入浓度为5%的亚硝酸钠水溶液1 mL，摇匀，静置6 min。分别加入10%的硝酸铝水溶液0.3 mL摇匀，静置6 min。分别加入浓度为4%的氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，最后用30%的乙醇定容至10 mL，摇匀，静置14 min，于510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线[8-10]。得到线性方程Y=0.917 1X-0.004 6(r=0.999 4)。表明在浓度为0.05～0.3 mg·mL-1范围内浓度与吸光度呈良好线性关系。根据标准曲线求得Box-Behnken设计方案中各供试液中总黄酮浓度，按下式计算总黄酮得率。

总黄酮得率=供试液浓度(mg·mL-1)×稀释倍数×体积(mL)/称取样品干质量(g)×1000

(1)

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性试验 取夏至草总黄酮提取液适量，按照2.3项下方法显色，并于0、15、30、45、60 min测定吸光度，计算相对标准偏差。结果RSD=4.15%，表明样品在室温下60 min内稳定。

2.4.2精密度实验 精密吸取芦丁对照品溶液1 mL，按照2.3项下方法显色，连续测量6次，计算相对标准偏差。结果吸光度的RSD为1.22%，试验结果表明该方法仪器精密度良好。

2.4.3重复性实验 取同一批样品5份，每份10 g，以优化的条件提取，按照2.3项下方法显色并测定吸光度，计算相对标准偏差。结果RSD为3.31%，表明该方法重复性好。

2.4.4加样回收实验 精密吸取已知浓度的供试品溶液1 mL共5份，分别加入1mL的芦丁标准品溶液，按照2.3项下方法显色并测定吸光度，计算平均回收率及相对标准偏差。结果平均回收率为82.6%，RSD=5.11%，表明方法的加样回收率符合要求。

2.5 单因素试验设计

以黄酮提取率为考察指标，按照上述总黄酮提取工艺，固定其他条件，分别考察不同乙醇浓度、液料比、提取温度对夏至草总黄酮提取率的影响。

由图2(A)可知，随着乙醇浓度的增加，夏至草总黄酮的提取率不断增加，当乙醇浓度达到60%时，总黄酮提取率达到最大，继续增加乙醇浓度，总黄酮提取率明显下降，因此乙醇浓度选择在50%～70%进行优化。

由图2(B)可知，随着液料比的增大，夏至草总黄酮的提取率增加，但当液料比超过40∶1后，总黄酮提取率变化不明显，为节约溶剂，因此液料比选择在30∶1～40∶1进行优化。

由图2(C)可知，随着提取温度的提高，夏至草总黄酮的提取率不断增加，当提取温度达到65 ℃时，总黄酮提取率达到最大，继续提高温度，总黄酮提取率略有下降，因此提取温度选择在60～70℃进行优化。

注：A.乙醇浓度对提取率的影响；B.液料比对提取率的影响；C.提取温度对提取率的影响。图2 夏至草总黄酮提取的单因素试验

2.6 Box-Behnken试验设计及响应面分析

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案[11-13]，以乙醇浓度A、液料比B、提取温度C为考察因素，以夏至草总黄酮提取率为响应值，利用Design-Expert v8.0.6软件优化夏至草总黄酮提取工艺。试验因素、水平编码见表1。设计方案及结果见表2，拟合二次多项式模型的方差分析见表3。对表2中的数据进行多元回归拟合，获得夏至草总黄酮提取率对自变量乙醇浓度A、液料比B、提取温度C的二次多项回归方程为：Y=-23.77+0.17A-0.29B+0.78C+1.5×10-4AC-1.495×10-3A2+4.32×10-3B2-6.08×10-3C2

表1 实验因素与水平

表2 Box-Behnken试验设计方案与结果

注：实验1～12为析因实验，13～17为中心实验。

由表3可知，P模型<0.01，说明模型高度显著；模型的相关系数r=0.969 8，校正决定系数RAdj2=0.894 3，二者相近，说明模型实际值与预测值拟合较好；模型失拟项是表示模型理论值与实际值不相拟合的概率，P失拟=0.673 9>0.05，模型的失拟度不显著，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程代表性较好，能准确预测实际情况，使用该方程代替真实的实验点进行分析是可行的。

由表3中的P值可以知道，方程中A、B、C、A2、B2、C2对Y值的影响均高度显著，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系。由回归方程可知乙醇浓度A与提取温度C有交互作用。A、C两因素回归方程响应面及等高线见图3，两个交互因素的响应面存在最高点，即在所选的范围内存在极值，说明各因素考察范围较为适当。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析

注：**.P<0.01为极显著水平；*.P<0.05为显著水平。

图3 提取温度与提取溶剂浓度对夏至草总黄酮提取率的响应面图

通过软件分析得到最佳提取工艺为乙醇体积分数为58.98%、液料比为40∶1，提取温度为64.76 ℃，在此条件下夏至草总黄酮的提取率为1.607 6%。为使试验操作简便，最终确定提取工艺为：乙醇体积分数为60%、液料比为40∶1、提取温度为65℃。

2.7 验证试验

精密称取夏至草6份，每份20 g，按2.1项下方法以最佳的提取工艺提取总黄酮，按2.2项下方法显色，510 nm处测定吸光度，总黄酮含量分别为1.611 1%、1.594 3%、1.564 8%、1.600 1%、1.584 4%、1.599 4%，平均含量为1.592 4%，RSD为1.007 7%，与软件分析所得的提取率相近，表明本研究确定的试验条件可行。

3 讨论

本文在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优化夏至草活性成分总黄酮的提取。实验结果表明，乙醇浓度、提取温度、液料比及的乙醇浓度、提取温度、液料比平方项对夏至草总黄酮提取率的影响显着，并且，乙醇浓度与提取温度具有交互作用。说明乙醇浓度、提取温度、液料比对夏至草总黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。

在前期研究中发现，超声功率及超声时间对夏至草总黄酮的提取率影响不大，所以在本实验中未考虑二者的影响，本实验采用超声(Hz=120 W)辅助提取10 min。回归分析和验证实验结果表明，此方法合理可行。得到夏至草总黄酮提取的最佳条件为：乙醇体积分数为60%、液料比40∶1、超声温度65 ℃，夏至草总黄酮提取率为1.592 4%。

该方法简便易行，灵敏度高，精密度高，重现性好，稳定可靠，可作为夏至草总黄酮的提取及含量测定方法；为以后夏至草总黄酮的提取和含量测定提供了方法与理论依据，为新药开发和工业化生产提供了实验基础。

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