基于PTEN的康莱特诱导人胰腺癌细胞凋亡作用

刘颖　孙学佳　肖铟　刘适　赵晶　秦伟

[摘要] 目的 研究康莱特注射液分别在PTEN正常表达和低表达时对人胰腺癌细胞凋亡的影响，进而评估康莱特注射液对胰腺癌的治疗作用。方法 该研究于2016年2月—2017年9月在哈尔滨医科大学公共卫生学院进行，人胰腺癌PANC-1细胞、沉默PTEN表达的胰腺癌PANC-1细胞分别分成康莱特处理组及未处理组，以流式细胞术检验胰腺癌细胞凋亡改变。结果 康莱特处理组胰腺癌细胞凋亡率（59.67±13.23）%明显高于对照组（13.26±4.72）%（P<0.01），shPTEN+康莱特组和shPTEN组细胞凋亡率（39.85±13.47）%和（27.37±8.62）%也高于对照组（13.26±4.72）（P<0.05）。 结论 康莱特注射液以调控PTEN 表达的方式诱导人胰腺癌细胞凋亡，康莱特注射液是一种治疗胰腺癌的潜力药物。

[关键词] 胰腺癌；康莱特；PTEN

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）02（c）-0023-03

PTEN - based Kanglaite Induces Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cells

LIU Yin1， SUN Xue-jia2， XIAO Yin1， LIU Shi3， ZHAO Jing3， QIN Wei4

1.Oncology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 2. Radiology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 3. General Surgery Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 4. Academic Affairs Office， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of Kanglaite Injection on the apoptosis of human pancreatic cancer cells in normal and low expression of PTEN， and to evaluate the therapeutic effect of Kanglaite injection on pancreatic cancer. Methods This study was carried out in Harbin Medical University School of Public Health from February 2016 to September 2017 Pancreatic cancer PANC-1 cells and PTEN-expressing pancreatic cancer PANC-1 cells were divided into Kanglaite treatment group and untreated group respectively. The apoptosis of pancreatic cancer cells was examined by flow cytometry. Results The apoptosis rate of pancreatic cancer cells in KLT group（59.67±13.23）% was significantly higher than that in control group （13.26±4.72）%（P<0.01）. The apoptotic rates of shPTEN + KLT group and shPTEN group （39.85±13.47）% and （27.37±8.62）% was also higher than the control group（13.26±4.72）%（P<0.05）. Conclusion Kanglaite injection induces apoptosis of human pancreatic cancer cells by regulating PTEN expression. Kanglaite injection is a potential drug for pancreatic cancer.

[Key words] Pancreatic cancer； Kanglaite； PTEN

胰腺癌是惡性程度最高的癌症之一，患者的5年生存率小于5%[1]，它的发病率有逐年升高的趋势，而现有的治疗措施效果差强人意，故而越来越多的新药物抗胰腺癌的相关研究在全球范围开展起来。康莱特注射液的主要成分是中药薏苡仁油[2]， 它在中国主要用于非小细胞肺癌、肝癌以及胃癌的辅助治疗[3-5]，它能以多种机制作用于多种信号通路或靶点发挥抗癌作用[2-4，6-11]，但是它抗胰腺癌的作用及机制却鲜有研究。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一个重要调控因子，也是一个非常重要的抑癌基因。该研究起始于2016年2月—2017年9月，该研究实验重复3次，该研究通过观察经康莱特注射液分别在PTEN正常表达或低表达时对人胰腺癌细胞凋亡的影响，初步阐释了康莱特注射液抗胰腺癌的机制，并将为康莱特注射液治疗胰腺癌的早日临床应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 PTEN基因沉默

人胰腺癌PANC-1細胞购于中科院生物化学与细胞生物学研究所，以慢病毒转导法沉默PANC-1细胞PTEN的表达。首先将含荧光素酶和PTEN的shRNA分别转导入人胰腺癌PANC-1细胞，转导24 h后更换培养基，随后在转导后的第36、48、60、72 h获取上清液，并将获得的上清液过滤、离心及重悬浮，最后把含有shLuc或shPTEN的慢病毒颗粒以适当浓度转导入人胰腺癌PANC-1细胞。用Western blot法检验PTEN基因沉默的效果。

1.2 细胞培养及处理

以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基分别培养PTEN正常表达和低表达的PANC-1细胞，首先用10 μL/mL的康莱特注射液或去离子水处理细胞48 h，以流式细胞术检验胰腺癌细胞凋亡改变。

1.3 细胞凋亡检测

把收获、洗涤后的PTEN正常表达和低表达的人胰腺癌PANC-1细胞分别加入10 μL异硫氰酸荧光素和10 μL碘化丙啶，随后在暗室中室温下培育10 min，然后用FACSCalibur流式细胞仪分析染色后的细胞，其中右下象限标示为早期凋亡细胞，右上象限标示为晚期凋亡细胞。

1.4 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件处理实验数据，数值采用均数±标准差（x±s）表示，t检验，3组及以上数值间差异采用单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果表明，将PTEN正常表达和低表达PANC-1细胞用10 μL/mL的康莱特注射液或去离子水分别处理48 h后，康莱特处理组细胞凋亡率明显高于对照组 （P<0.01）， shPTEN+康莱特组和shPTEN组细胞凋亡率也高于对照组 （P<0.05），详见图1。该研究结果证实康莱特处理组胰腺癌细胞凋亡率（59.67±13.23）%明显高于对照组（13.26±4.72）%（P<0.01），并且康莱特组细胞PTEN表达显著高于对照组（P<0.01），shPTEN组、shPTEN+康莱特组细胞凋亡率高于对照组（P<0.05）。

3 讨论

上述实验结果证实在康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞凋亡的过程中PTEN起到了关键性作用，而敲低PTEN基因的表达水平能够减弱康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞凋亡的作用。鲍英等人[12]的研究表明经20 μl/mL康莱特作用胰腺癌8988细胞72 h 后， 经TUN EL染色检测凋亡细胞比例为11.84%，而对照组为3.24 %，该实验结果与该研究的差异可能由于实验方法、细胞株及没进行多次实验所致的实验误差引起的。

PTEN基因是PI3K/Akt/mTOR信号转导通路关键的抑制因子之一，它的缺失或者失活都能够引起PI3K/Akt/mTOR通路的活化。PI3K/Akt/mTOR通路的激活能加速肿瘤组织血管生成，促使肿瘤细胞增殖、增强肿瘤的侵袭及转移能力，与此同时可以抑制肿瘤细胞凋亡 [13]。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一个重要调控因子，也是一个非常重要的抑癌基因。提高PTEN 基因的表达水平是康莱特注射液对PI3K/Akt/mTOR 信号通路的抑制作用机制之一， PTEN基因表达水平的降低可以在一定范围内减弱康莱特注射液对PI3K/Akt/mTOR 信号通路的抑制作用。康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞增殖凋亡作用的发挥在一定程度上是通过借助PTEN调控此通路实现的。

该研究在国际上首次研究了康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞凋亡的作用与PTEN基因的关系，初步揭示了康莱特注射液抗胰腺癌作用的机制，将为康莱特注射液治疗胰腺癌的早日临床应用提供理论支持。

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（收稿日期：2017-11-28）