红冬蛇菰化学成分预实验及其总酚、总黄酮含量测定*

张声源，温正辉，李云霞，林雅立，周 铭△（.嘉应学院医学院，广东梅州5403；.嘉应学院医学院附属医院药剂科，广东梅州5403）

红冬蛇菰（Balanophora harlandii）为蛇菰科（Bala⁃nophoraceae）蛇菰属（Balanophora Forst.）多年生肉质寄生草本植物，又名为“文王一支笔”和“石莲花”，主要产于广东、广西和云南等省区[1]。红冬蛇菰气味甘苦，无毒，具有活血化瘀、清热解毒等功效，民间常用于醒神、治酒积等[2]。我国是将蛇菰入药最早的国家，历代本草也有记述。其中《本草纲目》有较详细记载：“诸名山皆有之，惟太和山采取，云乃葛之精华也。秋霜浮空，如芝、菌涌生地，其色赤脆，盖罩类也。”[3]作者前期对广东省梅州市阴那山自然保护区进行了药用植物资源调查，结果显示，红冬蛇菰在该自然保护区资源较为丰富，当地群众常作为植物汤料制作药膳用于防治糖尿病和风湿类疾病；此外，由于红冬蛇菰外形独特，与肉苁蓉较为相似，当地也有部分群众根据“以形补形”中医养生理念将其制作为补肾药酒[4]。然而，目前国内外对红冬蛇菰的现代化学成分、质量标准、药理活性等方面的研究鲜有报道，导致其民间药用科学内涵等至今尚不明确[5]。本研究首次对红冬蛇菰进行了化学成分系统的预实验，初步确定了其可能含有的化学成分，以期为红冬蛇菰植物药用价值的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药材 红冬蛇菰于2016年10月采自广东省梅州市阴那山自然保护区，经嘉应学院医学院生药学教研室翟明教授鉴定为蛇菰科（Balanophoraceae）蛇菰属（Balanophora Forst）多年生肉质寄生草本植物红冬蛇菰（Balanophora harlandii）的全草，标本存放于嘉应学院医学院天然药物标本馆（编号：20161012）。

1.1.2 试剂 芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所（批号：10080-200707，纯度大于或等于98%），没食子酸对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：110831-200803，纯度大于或等于98%），1 N福林-酚试剂购自上海金穗生物科技有限公司（批号：20160117）。甲醇、95% 乙醇、石油醚（60～90℃）、氨水、三氯甲烷、浓硫酸、浓盐酸、正丁醇、镁、醋酐、冰乙酸、碘化铋钾、硼酸、碘、碘化钾、磷钨酸、铁氰化钾、三氯化铝、氢氧化钠、间二硝基苯、硅钨酸、三氯化铁、磷钼酸、氢氧化钾、2，4-二硝基苯肼、盐酸羟胺、乙酸镁、氢氧化钾、亚甲基蓝、4-氨基安替比林、亚硝酰、铁氰化钠、明胶、3，5-二硝基苯甲酸、锌粉、对二氨基苯甲醛、香草醛、氯化钠、溴酚蓝、茚三酮、酒石酸钾钠、氧化铝、硫酸铜、吡啶、苯甲酸、甲苯、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯。

1.1.3 仪器 UV-1800型紫外-可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]、JP-100S型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）、BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）、BS110s型电子分析天平（德国Sartorius公司）、N-1100V型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 红冬蛇菰化学成分预实验 按天然药物化学成分系统预试法进行红冬蛇菰石油醚提取液、乙醇提取液和水提取液的制备，通过传统试管预试方法结合纸色谱法进行挥发油、油脂、蛋白质、氨基酸、糖类、黄酮、蒽醌、香豆素、木质素、皂苷、生物碱、甾体、三萜等化学成分检测[6]。

1.2.1.1 石油醚提取液的制备 称取粗粉20 g，置于100 mL三角烧瓶中，加石油醚60 mL，振荡摇匀，密闭并多次振摇，室温放置7 d，过滤，得石油醚提取液，供挥发油、油脂、甾体、三萜等成分的检测。

1.2.1.2 乙醇提取液的制备 用“1.2.1.1”项实验后留下的药材，挥干石油醚，加入95%乙醇100 mL，加热回流提取1 h，过滤，滤液分为两部分：1份为乙醇提取液用作酚类、鞣质、有机酸、黄酮、蒽酮、香豆素、内酯、强心苷等成分的检测；1份经减压浓缩为醇浸膏，取1 g醇浸膏于10 mL试管中，加入2%氯化氢溶液3 mL，超声溶解，过滤，得醇浸膏酸水液，用于生物碱的检测。

1.2.1.3 水提取液的制备 用“1.2.1.2”项实验后留下的药材，挥干乙醇，置于200 mL三角烧杯中，加入100 mL蒸馏水，室温浸泡过夜，滤取10 mL滤液用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测。剩余的浸液及药渣在70℃水浴上热浸1 h，过滤，滤液用于糖类、多糖及其苷类、有机酸、酚类、鞣质等成分的检测。

1.2.2 总酚含量的测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 参照文献[7]的方法并进行适当调整，精密称取干燥至恒重的没食子酸标准品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.2 mg/mL的没食子酸标准溶液。分别精密吸取没食子酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，各加入6 mL蒸馏水，再加入0.5 mL福林试剂，充分摇匀避光静置5 min，再加7.5%碳酸钠溶液2 mL，用蒸馏水定容至刻度，混匀后在40℃水浴中避光放置60 min，冷却，于760 nm波长处测定其吸光度（A）值，以没食子酸A值为纵坐标（Y），没食子酸质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。

1.2.2.2 总酚含量测定 准确称取红冬蛇菰药材粗粉2.0 g，置于100 mL三角烧瓶中，加入95%乙醇50 mL，室温超声提取3次，合并滤液，滤渣洗涤3次，过滤，转移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.1 mL于10 mL棕色容量瓶中，后续处理方法与“1.2.2.1”项相同，测定供试品溶液的A值。平行测定3次。

1.2.3 总黄酮含量的测定

1.2.3.1 芦丁标准曲线的绘制 参照文献[8]的方法并进行适当调整，精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别精密吸取芦丁标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，各加水至7 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置4 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置4 min，加4%氢氧化钠试液10 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，用60%乙醇稀释至刻度，放置15 min，在510 nm处测A值，以试液空白为参比，平行测定3次。以芦丁质量浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

1.2.3.2 总黄酮含量测定 准确称取红冬蛇菰药材粗粉2.0 g，置于100 mL三角烧瓶中，加入95%乙醇50 mL，室温超声提取3次，合并滤液，滤渣洗涤3次，过滤，转移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液2.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，后续处理方法与“1.2.3.1”项相同，测定供试品溶液的A值。

2 结 果

2.1 化学成分预实验 初步鉴定出供试品溶液可能含有的化学成分及其类型，见表1～3。

表1 红冬蛇菰石油醚提取液化学反应结果

表2 红冬蛇菰乙醇提取液化学反应结果

表3 红冬蛇菰水提取液化学反应结果

2.2 红冬蛇菰总酚和总黄酮含量 没食子酸回归方程为Y=0.105 6X+0.025 7（R2=0.997 4），表明没食子酸含量在0.00～10.01µg/mL内呈良好的线性关系；芦丁回归方程为Y＝0.013 1X-0.000 3（R2=0.997 6），表明芦丁含量在0.00～49.26µg/mL内呈良好的线性关系。根据回归方程得红冬蛇菰中总酚中位体积分数为19.84%，总黄酮中位体积分数为30.42%。见表4。

表4 红冬蛇菰中总酚和总黄酮含量测定结果

3 讨 论

药用植物在其生长过程中通过代谢产生大量骨架结构多样和生物活性广泛的活性成分，一直是药物研究与开发的重要来源。

据统计，1981—2014年上市的新药中超过1/3直接或间接来源于天然产物；而在合成药物中也有相当部分借鉴了天然产物的骨架结构或药效团。另有统计表明，在目前全世界销售额最高的25种药品中有10种以上来源于天然产物或其衍生物[9-10]。

我国具有丰富的药用植物、微生物等生物资源，且具有传统的中医药理论体系，并具有长期的临床应用经验。因此，从药用植物中寻找和开发创新药物是一条适合我国新药研究与开发的途径。

红冬蛇菰（Balanophora harlandii）为蛇菰科（Bala⁃nophoraceae）蛇菰属植物，主产于广东、云南等省区，具有活血化瘀、清热解毒等功效，梅州市客家地区民间常用于防治糖尿病、妇科病和关节疼痛等病症[5]。

由于红冬蛇菰无人工种植，生长环境特殊，采摘周期短，加之宣传不足。迄今为止，国内外对红冬蛇菰的研究与开发鲜有报道，其所含活性成分尚不清楚，民间药用的科学内涵不明确，严重制约了其进一步的开发、利用。

本研究首次采用化学反应鉴别方法分别对梅州市山区野生红冬蛇菰的乙醇提取液、水提取液和石油醚提取液进行了探讨，并通过多种指示剂和显色剂的沉淀反应或颜色反应对红冬蛇菰可能含有的化学成分进行了初步分析；采用福林-酚比色法和硝酸铝络合分光光度法分别测定了红冬蛇菰乙醇提取物中总酚和总黄酮含量。结果显示，红冬蛇菰中可能含有多糖及其苷类、黄酮、酚类、鞣质、内酯、香豆素、甾体、三萜、油脂等多种化学成分，其中总酚中位体积分数为19.84%，总黄酮中位体积分数为30.42%。

总之，本研究初步确定了红冬蛇菰中可能存在的化学成分，并为其化学成分、质量标准、药理活性及药物开发的研究提供了科学依据。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1988：256.

[2]滕荣伟，王德祖，杨崇仁.蛇菰的化学成分[J].云南植物研究，2000，22（2）：225-233.

[3]WANG W，ZENG SF，YANG CR，et al.A new hydrolyzable tannin from balanophora harlandii with Radical-Scavenging activity[J].Helv Chim Acta，2009，92（9）：1817-1822.

[4]林大都，罗宝平，李兰芳，等.广东省阴那山自然保护区药用植物资源调查[J].今日药学，2015，25（4）：253-259.

[5]WANG X，LIU Z，QIAO W，et al.Phytochemicals and biological studies of plants from the genus Balanophora[J].Chem Cent J，2012，6（1）：79.

[6]裴月湖.天然药物化学实验指导[M].北京：人民卫生出版社，2016：140-158.

[7]关小丽，杨子明，颜小捷，等.8种壳斗科植物多酚含量及抗氧化能力[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（2）：65-69.

[8]李利华.芹菜不同部位总黄酮含量测定及其抗氧化活性[J].食品研究与开发，2013，34（7）：12-15.

[9]叶文才.中药及天然药物活性成分：新药研发的重要源泉[J].药学进展，2016，40（10）：721-722.

[10]NEWMAN DJ，CRAGG GM.Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010[J].J Nat Prod，2012，75（3）：311-335.