当归红芪超滤物对紫杉醇诱导体外大鼠肾足细胞损伤的保护作用*

朱琳菊，寇炜△，李竺娟，孙少伯，梁冰（.西北民族大学医学院，甘肃兰州730030；.甘肃中医药大学中西医结合系，甘肃兰州730000）

肿瘤是当今世界医学难题之一，紫杉醇（TAX）为经典抗癌药物，但其在发挥抗癌作用同时对肾脏具有一定的损伤作用，近年来，随着中药产业的发展，对当归红芪功效的科学研究日益增多，当归红芪超滤物（RASRH）已被证实具有良好的抗肿瘤作用[1-3]。但有关其是否对TAX导致的肾足细胞损伤具有保护作用的文献报道较少，为此，本研究借助大鼠肾足细胞，采用TAX处理，辅以超滤技术提取纯化的RAS-RH干预，利用分子生物学技术，从凋亡角度出发，研究RAS-RH是否对化疗药物损伤的肾足细胞具有保护作用，为其在临床中的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠肾足细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所，经甘肃中医药大学中西医结合实验室传代培养。

1.1.2 药物 中药红芪、当归均采自甘肃省岷县，经甘肃中医药大学药学院生药学教研室鉴定：红芪是豆科岩黄芪（hedysarum polybotrys hand⁃Mazz）属植物多序黄芪的干燥根茎，当归为伞形科植物[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根基，RAS-RH参照文献[4]制作流程和结果，由甘肃中医药大学科研实验中心与甘肃省膜科学技术研究院联合制备。

1.1.3 试剂及仪器 倒置相差显微镜为日本OLYMPUS产品，Thermo 311二氧化碳培养箱为美国Thermo公司产品，电动离心机为金坛市恒丰仪器厂产品，SCS-24摇床为上海市离心机械研究所产品，精密电子天平为北京赛多利斯仪器系统有限公司产品，高糖培养基、0.5%胰蛋白酶、TrizonX-100、胎牛血清、100X青霉素-链霉素溶液均为HyClone公司产品，超净工作台、流式细胞仪、16孔细胞电子检测板（E-Plate）、实时细胞分析（RTCA）仪均为艾森生物-杭州有限公司产品，TAX（E160101）购自上海谱振生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RAS-RH的制备 当归、红芪饮片以1∶5的比例混合，水煎煮2次，过滤水煎液并加热浓缩后用陶瓷膜微滤浓缩液，技术参数为压力0.2 mPa/m3、温度25℃、流量10 L/（h·m2）；选用截留相对分子质量为1×105聚丙烯腈（PNA）中空纤维超滤膜，超滤经微滤处理后的当归、红芪水煎剂浓缩液，技术参数为压力5～6 kg/m3、温度25℃、流量10 L/（h·m2）；将超滤液喷雾干燥成粉，相对生药材的得率为0.9%[4]。

1.2.2 分组及细胞处理 将大鼠肾足细胞分为对照组、药物组、TAX组和联合组。TAX组一次性给予TAX 0.5µg/mL处理24 h，药物组给予RAS-RH 10µg/mL培养24 h，联合组先给予RAS-RH 10µg/mL培养24 h后再一次性给予TAX 0.5µg/mL处理24 h。

1.2.3 RTCA 检测板前4孔加入150µL高糖培养基，后4孔加入150µL RAS-RH，放入RTCA Station中测定基线，保证每孔接触正常且细胞指数在正常值内。取制备好的大鼠肾足细胞悬液分别以每孔4×103个接种于E-Plate中，在超净台中静置30 min后置于培养箱中的RTCA工作站中，每15分钟记录细胞指数，总时长96 h。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 用0.25%胰酶消化收集各组细胞后预冷磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞，在染色缓冲液中5×105/mL重悬细胞，吸取100µL细胞（1×105）至试管中，加入5µL荧光标记的Annexin V（胞内蛋白膜联蛋白家族成员）和3µL碘化丙啶，混匀后避光室温孵育15 min，孵育后加入400µL染色缓冲液，用流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析、t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAX对大鼠肾足细胞增殖的抑制作用 TAX组大鼠肾足细胞增殖受到明显抑制，联合组大鼠肾足细胞生长明显优于TAX组。见图1。TAX对肾足细胞具有较强的生长抑制作用，其抑制程度在一定时间内（72 h）随作用时间增加而增强；联合组大鼠肾足细胞生长优于 TAX组，差异有统计学意义（P＜0.05）；TAX处理肾足细胞的半抑制浓度（IC50）值为 4.700µg/mL，24 h后达到最大抑制率。见图2。

图1 各组大鼠肾足细胞生长情况比较（倒置相差显微镜，200×）

图2 各组大鼠肾足细胞情况比较（RTCA实时分析）

2.2 RAS-RH对肾足细胞凋亡的影响 除药物组大鼠肾足细胞凋亡率[（6.24±0.35）%]与对照组[（2.68±0.11）%]比较，差异无统计学意义（P=0.093）外，TAX 组大鼠肾足细胞凋亡率[（20.59±3.74）%]均明显高于对照组、药物组、联合组[（10.59±2.14）%]，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。

图3 各组大鼠肾足细胞凋亡率比较

3 讨 论

《中国药典》记载当归为伞形科植物[Angelica sinen⁃sis（Oliv.）Diels]的干燥根，具有“补血、活血、调经止痛”等功效[5]。但陈曦等[6]利用阴离子SephadexG-100凝胶柱色谱分离纯化当归多糖，得白色粉末状多糖APS-bⅡ，采用四甲基偶氮唑盐法观察发现，APS-bⅡ对人肝癌HepG2、乳腺癌 MCF-7、宫颈癌 HeLa、结肠癌 SW1116细胞株均具有抑制其生长、增殖的作用。

红芪为豆科岩黄芪（Hedysayum polybotrys hand⁃Mass）属植物，《中国药典》收载的常用中药红芪为多序黄芪的根基，红芪入药史载于南北朝梁-陶弘景著的《本草经集注》，具有“扶正祛邪、益气固本”的功效[5]。李世刚等[7]利用高效色谱得到均一性的红芪多糖，结果发现，红芪多糖可明显抑制人肝癌HepG2、胃癌MGC-803细胞增殖，使G0/G1期比例下降，G2/M期比例升高，增加其凋亡率，其机制可能是通过降低B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）的表达，升高半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）的表达有关。

本研究通过采用倒置相差显微镜法和RTCA观察发现，TAX对大鼠肾足细胞的增殖具有明显的抑制作用，RAS-RH对TAX导致的损伤具有一定的保护作用。

陈曦等[8]利用RNA干扰技术抑制了胃癌细胞SGC-7901 Bcl-2基因的表达，结果发现，Bcl-2小RNA分子可下调胃癌细胞SGC-7901 Bcl-2基因表达，诱导细胞凋亡，增强 TAX的敏感性，合用TAX、Bcl-2小RNA具有显著增强协同作用，比任何单独用药的细胞凋亡率高。王阳等[9]采用四甲基偶氮唑盐法检测了人乳腺癌MCF-7细胞增殖活性，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果发现，芹黄素联合TAX可协同抑制细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡的作用显著增加。另外，TAX的作用机制独特且复杂，现在普遍认同的作用机制有以下几个方面：如微管解聚稳定机制[10]、免疫机制、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移等。其中可作用于细胞凋亡受体途径的细胞凋亡膜表面分子通路[11]或激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族均可诱导细胞凋亡。段永顺[12]认为，TAX可通过将肾癌细胞阻滞在G2/M期，从而起到抑制肾癌细胞增殖的作用。

朱贝贝等[13]通过原代培养大鼠乳鼠心肌细胞，采用X射线照射心肌细胞建立辐射损伤模型，采用不同浓度当归红芪多糖进行干预，结果发现，辐射致心肌细胞凋亡的机制之一是线粒体凋亡通路的激活，而当归红芪多糖可通过调控凋亡通路起到保护心肌细胞的作用。由此作者联想到，抗癌药物TAX对肾足细胞损伤的作用是由于凋亡因子的表达下调机制，而当归红芪多糖是否对TAX造成的大鼠肾足细胞损伤也会有类似的保护机制。为此本研究采用倒置相差显微镜观察了大鼠肾足细胞增殖抑制过程，结果发现，TAX组大鼠肾足细胞生长、增殖明显受到抑制，且细胞生长、增殖曲线与药物浓度在一定时间内呈依赖关系，流式细胞仪检测细胞凋亡率为（20.59±3.74）%，RAS-RH联合TAX可保护TAX造成的大鼠肾足细胞的损伤，联合组细胞增殖数明显高于TAX组，同时，细胞增殖抑制曲线也高于药物组，且TAX组大鼠肾足细胞凋亡率均明显高于对照组、药物组、联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明RAS-RH可降低TAX诱导的大鼠肾足细胞凋亡。表明TAX可通过诱导大鼠肾足细胞凋亡，进一步激活凋亡通路造成肾足细胞的损伤；RAS-RH具有抑制细胞基因表达，进一步下调线粒体凋亡通路相关凋亡因子的产生而发挥肾足细胞保护作用。

综上所述，RAS-RH对TAX诱导的大鼠肾足细胞损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是RAS-RH通过下调大鼠肾足细胞凋亡率而实现的，但RAS-RH如何具体影响凋亡细胞的分子机制尚有待于进一步研究。

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