一种篮式生物反应器内Vero细胞计数方法的建立

周 蕾, 陈 建 民, 王 鑫, 宋 云 增, 张 春 枝

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.大连雅立峰生物制药有限公司, 辽宁 大连 116620 )

0 引 言

生物反应器微载体细胞培养技术已广泛应用于生物制药业，它实现了动物细胞的大规模、高密度培养。此技术培养的细胞种类越来越多，规模越来越大，生产产品的种类也越来越多。例如，Celltech公司建立了10 000 L的细胞生物反应器，培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体[1-2]。应用培养杂交瘤细胞生产多克隆抗体[3-4]，培养Vero细胞制造病毒产品。巴斯德研究所曾对用生物反应器培养Vero细胞制备狂犬病疫苗做过详细的报道[6]。我国目前生物反应器的应用越来越广泛，技术也逐渐成熟，尤其在人用疫苗生产方面应用较多[6-7]。

载体按外形可分为片状载体和球状载体两大类，虽然Hassanzadeh等[8]研究证明了FibraCel disks片状载体培养Vero细胞制备狂犬病疫苗的产量高于Cytodex-1球状载体，但因片状载体被固定在反应器的篮筐内无法取样，使得细胞计数成为一大难题，从而导致片状载体的应用受到一定的影响。为了解决这一问题，推广片状载体的应用，本实验建立了一种简单快捷的用于篮式生物反应器(片状载体)内的细胞计数方法，以期为片状载体工艺中的细胞计数提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料与试剂

Vero细胞，原始细胞株来源于美国菌种保藏中心，实验用细胞为大连雅立峰生物制药有限公司提供的工作细胞库细胞。

含4%胎牛血清、终浓度4 mmol/L谷氨酰胺的细胞生长液，M199培养基，含胰蛋白酶和EDTA 的细胞消化液，PBS(酚红)溶液。所有溶液均经过0.22 μm除菌过滤。

1.1.2 主要设备

BioFlo310型篮式生物反应器，美国NBS公司；SF系列活细胞在线分析仪，德国ABER公司；SBA-40E型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；SHXJ-Ⅷ型生物细胞菌苗培养机，兰州飞控仪器总厂生化设备制造厂；XIT4S0001型完整性检测仪，默克化工技术(上海)有限公司；筒式除菌滤器，赛多利斯公司。

1.2 方 法

1.2.1 Vero细胞浓度与电容对应关系的确定

利用德国ABER活细胞在线分析仪监测反应器内Vero细胞所释放的电容计算细胞数量，但因不同细胞所释放的电容不同，故先用已知浓度的Vero细胞校准ABER活细胞在线分析仪的电容电极，求得校准系数(K)。

取细胞冻存管1支，经细胞复苏及传代扩增后制成10瓶T25方瓶Vero细胞，消化后将细胞悬液收集在1个方瓶内。取1 mL细胞悬液先进行人工计数，用ABER活细胞计数仪测量方瓶内的电容。每次测量后将方瓶内的细胞悬液进行稀释，进行人工计数和电容测量，反复12次。用Excel绘制电容与细胞数线性关系图，得到一次线性方程，求得K，即1 F电容相当于多少个Vero 细胞数。

1.2.2 生物反应器内细胞培养阶段葡萄糖消耗量与细胞数量关系的建立

将ABER活细胞计数仪的检测探头插入生物反应器罐体内，连续测量反应器内各个阶段Vero细胞所释放的电容。同时，在Vero细胞生长过程中间歇性取出反应器内培养液样品，用SBA-40E型生物传感分析仪检测培养液中的葡萄糖含量和乳酸含量。

当反应器内培养液的葡萄糖质量浓度下降至1.2 g/L时，向反应器内注入新鲜的细胞生长液，并维持葡萄糖质量浓度不低于0.8 g/L。记录连续监测到的葡萄糖质量浓度、乳酸质量浓度、电容，根据K，将电容折算为Vero细胞数，用Excel绘制细胞数与葡萄糖消耗量的线性关系图，建立葡萄糖消耗量与Vero细胞数之间的关系。

2 结果与讨论

2.1 标准系数(K)的确定

将12次测量所得的细胞浓度与电容统计于表1中。根据表1数据，利用Excel表格绘制Vero 细胞浓度与电容的线性关系，得到一次线性方程：y=299 011x-86 490，R2=0.980 1。实际上当x=0时，y也应为0，考虑到在细胞计数过程中存在一定的偏差，因此方程中的常数忽略不计，得到细胞浓度与电容之间的关系：y=299 011x，即K=2.99×105个/(mL·F)。

表1 不同细胞浓度下的电容

2.2 反应器内葡萄糖消耗量与细胞数的关系

根据“2.1”所得K，将不同时间点所监测的电容转化为Vero细胞数，根据葡萄糖消耗量，得到Vero细胞数与葡萄糖消耗量的线性方程y=0.534 5×109x。当x=1时，y=5.345×108，即每消耗1 g葡萄糖可供5.345×108个Vero细胞生长繁殖。Vero细胞数与葡萄糖消耗量关系公式为

N=5.345×108×m

式中：N为Vero细胞数，个；m为葡萄糖消耗量，g；5.345×108为系数，个/g。

史秀山[9]研究发现，每生长繁殖106个Vero消耗7.2×10-3mmol葡萄糖，即每消耗1 g葡萄糖可供7.71×108个Vero细胞生长繁殖。实验结果与文献[9]结果略有差异，在正常范围。

2.3 Vero细胞在生物反应器内的生长周期

Vero细胞在前36 h生长缓慢，处于停滞期，此阶段细胞在逐渐适应新的生长环境，并不断地合成前体，为细胞的增殖做准备。36 h后，细胞进入对数生长期，葡萄糖消耗量开始不断增加，在96～120 h达到生长的最高峰，而后处于平衡期。对于需要接种病毒的细胞来说，此时接种最佳。生物反应器为Vero细胞培养阶段的生长曲线见图1。

图1 生物反应器内Vero细胞的生长曲线

2.4 生物反应器中Vero细胞培养阶段葡萄糖的代谢

在Vero细胞培养的120 h内，葡萄糖消耗总量累计约230 g。在培养前30 h，耗糖量21～26 g，平均葡萄糖消耗速率约为0.8 g/h；48～65 h，平均葡萄糖消耗速率上升为1.5 g/h；84～120 h时葡萄糖消耗速率最快，为3.0～3.5 g/h。

随着培养时间的延长，细胞数量不断增加，葡萄糖的消耗速率也随之增加，为保证罐体内培养环境的相对稳定，培养期间不断增加灌流速度，将罐体内葡萄糖质量浓度控制在(1.0±0.2) g/L，既保证为细胞生长繁殖提供充足的营养物质，使细胞保持良好的生理状态，又能最大限度地利用培养基，节约培养基成本。

Vero细胞培养阶段罐内葡萄糖剩余质量浓度及消耗情况见图2、图3。

图2 不同培养阶段葡萄糖的剩余量

图3 不同培养阶段葡萄糖的消耗量

2.5 葡萄糖消耗与乳酸生成的关系

Vero细胞生长所消耗的葡萄糖，绝大多数通过糖酵解途径生成乳酸，许多研究表明乳酸对细胞生长具有毒性，且不同细胞的耐受能力不同。乳酸浓度低于24.8 mmol/L时，对细胞生长的影响较小；乳酸浓度高于30 mmol/L时，对细胞的影响较大，细胞存活率在培养过程中快速下降。

图4为反应器细胞Vero培养阶段罐内乳酸含量水平，整个细胞培养阶段仅个别时间点的乳酸质量浓度最高，达到了2.5 g/L(27.8 mmol/L)，其他绝大多数时间内，乳酸质量浓度均在2.2 g/L(24.4 mmol/L)以下，对细胞生长影响较小。

图4 不同培养阶段产生乳酸的质量浓度

随着葡萄糖消耗量及消耗速率的增加，乳酸的生成量也随之上升，在12次平行实验中，获得反应器Vero细胞培养前30 h的葡萄糖消耗和乳酸生成数据，结果如表3所示。由表3可知，每消耗1 mmol葡萄糖约生成1.71 mmol乳酸，这与史秀山[9]研究的每消耗1 mmol葡萄糖约生成1.66 mmol 乳酸结果基本一致。

表3 细胞培养前30 h的葡萄糖消耗量和乳酸生成量关系

Tab.3 The relationship between glucose consumption and lactic acid generation in the first 30 h of cell culture stage

实验次数c/(mmol·L-1)葡萄糖乳酸cL/cG1127.8221.71.732133.3198.31.493127.8221.71.734116.7198.31.705116.7198.31.706144.4245.01.707138.9256.71.858144.4256.71.789138.9233.31.6810138.9233.31.6811133.3233.31.7512116.7198.31.70平均值131.5224.61.71注:cL/cG表示乳酸生成量和葡萄糖消耗量的比值。

3 结 论

通过采用ABER活细胞计数仪在线监测和葡萄糖质量浓度离线检测相结合的方法，建立了葡萄糖消耗量和Vero细胞数之间的计算关系。5 d累积消耗葡萄糖230 g，获得Vero细胞1.2×1011～1.3×1011个,即每消耗1 g葡萄糖可供5.345×108个细胞生长，为BioFlo310型篮式生物反应器Vero细胞培养提供一种计数方法。实验也对生物反应器内Vero细胞不同培养阶段的生长周期、葡萄糖代谢情况及葡萄糖消耗与乳酸生成的关系等进行了研究，对优化培养工艺、确定培养过程关键控制指标等提供参考依据。

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