辐照处理对魔芋葡甘聚糖肠道益生作用的影响

李美英，冯观萍，徐振林，孙远明*

（华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，广东 广州 510642）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是天南星植物科魔芋属多年生草本植物魔芋的主要独特成分，其主链由D-葡萄糖和D-甘露糖以物质的量比为1∶1.5～1∶1.6（花魔芋）或1∶1.69（白魔芋）连结而成，主链上的甘露糖的C3位键上有以β-1,3键结合的支链结构，每隔19 个糖残基存在一个乙酰基团[1-2]。KGM主链以β-1,4糖苷键连结，不能被机体消化酶水解吸收，具备水溶性膳食纤维特性，对肠道健康具有突出的保健功能[3]。KGM吸水性强，能够增大粪便体积，促进肠蠕动及粪便排泄，减少有毒物吸收，发挥肠道清道夫作用[4]。KGM到达结肠部位后，在肠道微生物作用下发酵产酸，生成乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，同时促进肠道双歧杆菌、乳杆菌等有益菌增殖，抑制有害菌生长，调节肠道菌群，具有良好的肠道益生元作用[5-6]。近年来许多报道证实KGM的肠道益生元作用是其发挥减肥降脂[7-8]、调节免疫力[9]、抵御氧化损伤[10-11]、预防结肠癌[12]等生物学作用的重要途径，因此评价各类KGM及衍生物的肠道益生性对预估KGM生物学活性具有重要意义。

KGM具有良好的流变学及凝胶特性，1994年被美国食品药品监督局认定为食品添加剂，作为稳定剂及扩散剂广泛应用于各类食品及饮料中[13]。天然KGM相对分子质量非常高，水溶液黏度大，流变性能差，使其在食品工业中的应用受到限制[14]。目前，常采用物理或化学手段对KGM进行改性，改善其物理、化学、生物学性能，以期拓展其在食品领域的应用[15-17]。γ射线是一种具有高能量、长射程和强穿透力的离子流，常用于高聚物的改性。采用γ射线进行辐照改性，较好保持了食品外观性质和风味，同时避免了化学改性过程中有毒物质残留及对环境的污染，已成为魔芋改性研究的一大热点[18]。以往研究多关注γ射线辐照后KGM理化性质、加工性能的变化，对KGM生物学活性的影响尚不明确。本课题组前期开展了KGM辐照改性的系列研究，发现KGM经γ射线辐照改性分子质量下降，黏度降低，生成羰基或双键，晶体结构受到部分破坏，有助于提高酶解效率[19-22]。低聚糖的益生元特性受其理化性质及分子微观结构的影响[23]。辐照改性所带来的以上理化性质的改变，对其肠道益生性会产生怎样的影响，有待进一步研究。本研究以60Co为辐射源制备不同辐照剂量KGM样品，采用健康志愿者粪便体外厌氧发酵，比较KGM辐照样品发酵液pH值、短链脂肪酸产生量的变化趋势及益生元指数（prebiotic index，PI）的差异，探讨辐照剂量对KGM肠道益生性的影响，为KGM加工过程的辐照改性提供直接的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

KGM由湖北十堰花仙子魔芋制品有限公司提供，采用辐照剂量分别为0、10、20、30 kGy的60Co-γ射线室温下进行辐照后密封保存。

乙酸、丙酸、丁酸（色谱纯） 德国CNW公司；胆汁酸盐、氯化血红素 合肥博美生物科技有限责任公司；EMB大肠杆菌培养基、SPS产气荚膜梭菌培养基、MRS乳酸杆菌培养基、BS双歧杆菌培养基、GAM肠道群菌培养基 北京陆桥生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

CTO-10AS液相色谱仪 日本岛津公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱 培英实验仪器有限公司；厌氧培养箱美国Sheldon Manufacturing公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；HVE-50全自动高压灭菌锅 日本Hirayama公司；5417R小型台式冷冻型离心机 德国Eppendorf公司；ME104/02电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 健康人粪便提取液制备及基本发酵液制备

收集健康志愿者的新鲜粪便，志愿者年龄介于21～25 岁，身体健康，未患有消化系统疾病，至少3 个月未服用或注射过抗生素类药物，粪便收集过程尽量保持无菌，将收集的粪便立即用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（1 mmol/L，pH 7.0）按照1∶10（m/V）的比例稀释，充分混匀，过滤即得粪便提取液。粪便样品的采集与提取液制备的整个过程于30 min内完成，即用即配。

静置发酵培养基的配制在Rycroft等[24]方法的基础上进行改动，调节培养基初始pH值为6.7，后期发酵过程中不再控制调节，调配完成的培养基装入锥形瓶中高压蒸汽灭菌（121 ℃，20 min）后保存待用。

1.3.2 体外发酵

称取葡萄糖及KGM样品各0.2 g于发酵培养基中，调节发酵液糖质量浓度为10 g/L，以葡萄糖作为实验阳性对照组，空白对照组无碳源。接种新鲜粪便提取液至发酵液，摇匀置于37 ℃恒温培养箱中分别厌氧发酵0、6、12、18、24 h，每个样品做3 个平行实验。取不同发酵时间的发酵液，以20 g/L CuSO475 μL终止发酵，振荡混匀后13 000 r/min离心10 min去除菌体和沉淀物，测定上清液pH值；另取部分上清液用0.22 μm滤膜过滤，用于测定短链脂肪酸。

1.3.3 短链脂肪酸含量测定

参考张萍[25]、谭力[26]等的方法并做适当修改，采用液相色谱测定发酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量，将三者之和作为总酸含量。液相色谱条件：色谱柱为Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速为1 mL/min，检测波长为215 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL；流动相：PBS（pH 2.7）-乙腈（90∶10，V/V），等浓度洗脱。

1.3.4 发酵液菌落计数及益生性评价

取0 h及24 h发酵液各1 mL，用生理盐水以1∶9（V/V）依次连续稀释至各种菌适宜的计数浓度，每个稀释度分别接种100 μL于各培养板上，大肠杆菌采用EMB培养基，肠道群菌采用GAM培养基，放入恒温培养箱培养24 h后计数；产气荚膜梭菌采用SPS培养基，乳酸杆菌采用MRS培养基，双歧杆菌采用BS培养基，放入厌氧培养箱中培养24 h后计数，记录各菌群的数量，结果以lg（CFU/mL）表示。依据Palframan等[27]的方法计算PI，作为评价KGM样品益生性的指标，按下式计算。

式中：Bif、Esc、Lac、Clos分别表示静置发酵一段时间后双歧杆菌数、大肠杆菌数、乳酸杆菌数和产气荚膜梭菌数与对应初始菌数之比；Total表示静置发酵一段时间后总菌数与初始总菌数之比。

1.4 统计分析

采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，结果以表示，两两比较采用最小差异法，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 发酵液pH值的变化

图1 不同发酵液pH值的变化Fig. 1 Changes in pH in different samples during fermentation

寡糖在结肠部位经微生物作用，发酵产酸，改变肠道pH值，维持肠道酸性环境。图1为各种发酵液pH值变化趋势图，从图中可看出，发酵时间在0～12 h之间，除空白对照组外，各组KGM样品pH值均发生了明显下降，其中阳性对照组的pH值下降趋势最明显，其次为30、20、10 kGy和0 kGy KGM，12 h后30 kGy和20 kGy KGM的pH值改变趋于平缓，而10 kGy和0 kGy KGM的pH值依然持续下降。发酵液pH值的高低可间接反映发酵过程有机酸的生成情况，与肠道微生物作用发酵样品的速度和程度有关[28]。葡萄糖糖链较短，最易被肠道微生物充分利用，发酵初期产酸明显，pH值下降显著。课题组前期研究发现KGM经辐照改性后分子链发生断裂裂解，辐照剂量越大，分子质量下降越明显[22]，被肠道微生物充分利用所需时间越短，发酵产酸更充分，故高辐照剂量KGM较早到达低pH值平台期值，且pH值下降幅度最明显。

2.2 短链脂肪酸生成量的变化

图2 不同发酵液短链脂肪酸生成量的变化Fig. 2 Changes in short chain fatty acid concentration in different samples during fermentation

从图2中可看出，KGM的发酵产物中以乙酸的生成量最多，其次丙酸，丁酸最少。随着发酵时间的延长，KGM样品发酵液中的乙酸、丙酸和丁酸生成量随之增加，到24 h，0、10、20、30 kGy KGM的短链脂肪酸总生成量较发酵0 h时分别增加了17.7、25.89、29.87、31.24 mmol/L；与阳性对照葡萄糖相比，0、10、20、30 kGy KGM发酵液24 h短链脂肪酸总生成量分别是阳性对照组的1.8、2.6、3.0、3.1 倍。从这些对比数据可看出，辐照剂量越大，KGM发酵液短链脂肪酸的生成量越高，与图1中各样品发酵液的pH值变化曲线基本一致。膳食纤维在结肠内发酵，其短链脂肪酸生成情况与膳食纤维理化性质密切相关，Nilsson等[29]发现短链脂肪酸的生成受其单糖组成及连接方式、分子质量、聚合度、溶解度等多种因素影响。通常来说，分子质量及聚合度较低、溶解度较高的多糖在结肠发酵中其短链脂肪酸总生成量更高。以往研究发现，辐照处理能提高KGM在水中的溶解度，同时导致KGM分子质量及聚合度下降[21-22,30]。本研究中KGM经辐照后短链脂肪酸生成量增加可能与辐照改性使KGM糖苷键及双键发生断裂裂解，其溶解度增加，使其更容易被肠道微生物利用有关[31]。

2.3 发酵液微生物数量的变化

人体结肠内定植着大量肠道菌群，包含有益菌及有害菌，两者相互制约，平衡生长。本研究选择双歧杆菌和乳杆菌作为肠道菌群有益菌的典型代表，大肠杆菌和产气荚膜梭菌作为潜在有害菌的代表。

表1 发酵液微生物数量变化Table 1 Changes in bacterial populations in different samples during fermentation lg（CFU/mL）

从表1可知，与0 h相比，各KGM样品发酵24 h后，发酵液中双歧杆菌与乳酸杆菌数量增加，大肠杆菌与产气荚膜梭菌数量下降，说明KGM能促进有益菌增殖，抑制有害菌生长，显示了其潜在的益生性能，这与以往研究结果一致[5]。比较不同辐照剂量的菌群数量变化，10、20、30 kGy KGM发酵液双歧杆菌数目较0 kGy KGM高（P＜0.05），其余菌种不同辐照剂量KGM组间差异不明显（P＞0.05）。微生物增殖与结肠微环境密切关联，不同膳食纤维对肠道微环境影响不尽相同，KGM经辐照后，其肠道pH值下降（图1），各种短链脂肪酸生成量增加（图2），肠道微环境发生变化，促使其微生物构成发生相应改变。

2.4 B/E值的变化

荷兰学者van der Waaij等[32]将肠道内双歧杆菌和肠杆菌数量对数值的比值（B/E值）作为肠道菌群定植抗力的指标，反映肠道菌群结构。

图3 不同发酵液的B/E值Fig. 3 B/E values of different samples during fermentation

由图3可知，各KGM样品的B/E值较空白组高，反映KGM可改善肠道菌群结构，有利肠道有益菌定植。不同辐照剂量KGM的B/E值结果显示，0、10、20、30 kGy KGM的B/E值分别是1.25、1.40、1.49、1.47。可看出在0～20 kGy辐照范围内，随辐射剂量增大，KGM的B/E值随之增大，30 kGy KGM的B/E值较20 kGy KGM稍有下降，但差异不明显。说明辐照改性有助于KGM促进肠道有益菌定植，改善肠道菌群结构。

2.5 益生元指数的变化

PI是Palframan等[27]提出的体外模型中衡量低聚果糖益生元作用的指标，它可以避免因取样接种不均衡、初始菌量和总菌数目不一致所导致的结果偏差。通过比较PI的大小，可定量描述各类低聚糖的益生元作用。

图4 不同发酵液的PIFig. 4 PI values of different samples during fermentation

本实验引入PI值评价不同辐照剂量KGM的益生元作用，由图4可知，0、10、20、30 kGy KGM的PI分别为0.48、0.61、0.76、0.78，是阳性组PI的2.1、2.7、3.3、3.4 倍，体现了KGM经小剂量辐照改性后具有更佳的肠道益生作用；20 kGy辐照可显著提高KGM的PI，20 kGy与30 kGy KGM的PI差异并不明显，表明辐照剂量达到一定程度后，对KGM肠道益生性的影响有限。肠道发酵过程复杂，肠道菌群结构受众多因素共同作用。KGM分子质量大、黏度高，经辐照后，其分子质量变小、黏度降低、溶解度增大，更易于被肠道微生物利用，发酵产酸，调节肠道环境，促进有益菌增殖，肠道益生性作用增强。

3 结 论

本实验采用健康志愿者粪便体外厌氧发酵，研究了不同辐照剂量KGM的肠道益生作用，结果表明，与阳性对照葡萄糖相比，KGM具有更好的益生元特性，表现为促进乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸生成，显著降低pH值，促进双歧杆菌及乳杆菌等有益菌增殖，抑制肠杆菌等有害菌生长，显著提高B/E值及PI，此结果进一步证实KGM具有显著的肠道益生作用，有助于促进肠道健康。不同辐照KGM肠道益生性的评价结果显示，在0～30 kGy的辐照范围内，随辐照剂量的增大，KGM发酵液pH值下降显著，短链脂肪酸生成量增加，同时PI随之增加，0、10、20、30 kGy KGM的PI值分别为0.48、0.61、0.76、0.78，说明KGM经小剂量辐照改性后具有更佳的肠道益生作用。对比辐照剂量增值对短链脂肪酸、B/E值及PI的影响幅度可发现，辐照剂量20 kGy以上时，辐照剂量的增加对肠道益生性的影响幅度明显变小，综合考虑辐照效率，可将20 kGy作为KGM辐照改性的适宜辐照剂量。

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