抗氧化剂硫辛酸分子自组装体系及印迹聚合物的制备

黄运安，许 龙,2，杨博文，朱秋劲,3,*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；3.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025）

α-硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）是一种来源于原核和真核细胞的含硫辅因子[1]，其化学名称为1,2-二硫戊环-3-戊酸，主要来源于动物肝脏组织及菠菜等植物，首次于1950年由美国Reed等[2]从猪肝中分离得到。ALA和其还原态二氢硫辛酸（dihydrolipoic acid，DHLA）独特的抗氧化能力成为了医药、食品领域的研究热点[3-4]。通常抗氧化物质是在其还原态具有抗氧化特性，而ALA与其还原态DHLA均具有抗氧化性，根据Packer等[5]对抗氧化物质的评价标准，ALA和DHLA满足理想抗氧化物质的所有条件，因此被称为“万能抗氧化剂”[6]。另外，ALA的相对分子质量较低，其分子质量比水溶性抗坏血酸大并远小于脂溶性生育酚，并且由于具有羧基末端以及比抗坏血酸更多的碳原子（ALA与DHLA结构如图1所示），这使其兼具水溶性和脂溶性[7]。

图1 ALA（a）和DHLA（b）的化学结构Fig. 1 Chemical structure of ALA (a) and DHLA (b)

目前，α-硫辛酸已在医药方面广泛用于治疗糖尿病及相关并发症[8]，在化妆品方面用于修复肌肤、抗皱延缓衰老[9]，在保健食品方面常用于预防自由基引起的各种急慢性症状，并可作为VC、VE等维生素补充剂[10]，但由于化学合成硫辛酸的某些未知的安全性限制了其在食品领域中的应用[11]，因此研究天然硫辛酸纯化、分离技术对其在食品领域的应用十分重要。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一种可以应用于不同领域的具有吸附、释放或特异性识别的高分子聚合物，具有选择性好、稳定性好和制备简单等优点[12]。MIPs在分析领域应用广泛，且作为分离、纯化材料被认为是生物大分子的优越替代材料[13-15]。为了快速筛选MIPs印迹比例，提高印迹识别能力，从分子水平上探讨MIPs印记识别原理，计算机模拟广泛应用于探究MIPs体系[16-17]。本研究应用密度泛函理论（density functional theory，DFT）在B3LYP水平下利用Gaussain软件模拟分析ALA和N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）自组装体系，并以ALA为印迹分子、NIPAM为功能单体制备了硫辛酸分子印迹聚合物（ALA-MIPs），为ALA-MIPs在天然ALA的富集和分离应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ALA（纯度99%）、DHLA（纯度98%）、3-苯基丁酸（3-phenylbutyric acid，PBA；纯度93%）、NIPAM（纯度97%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA；纯度97%） 美国Sigma-Aldrich公司；偶氮二异丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN；纯度99%） 阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZORBAX SB-C18色谱柱 美国安捷伦科技有限公司；P230Ⅱ高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有可变波长紫外检测器和EC2006 V1.70色谱数据处理系统） 大连依利特分析仪器有限公司；SPECTRA Max 190酶标仪 美谷分子仪器有限公司；730.009-QG石英微孔板 德国Hellma公司；S-3400N扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Frontier傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）仪 美国PerkinElmer公司；LRH生化培养箱上海一恒科技有限公司；TG16-WS高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；数显恒温水浴振荡器 金坛市良友仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理论计算方法

应用DFT在Gaussian View 5.08软件中构建分子模型，在B3LYP水平下，应用6-31G+（d）基组分别对ALA和NIPAM进行几何构型优化和分子静电势（molecular electrostatic potential，MEP）计算，应用6-311++（d，p）基组进行复合物结构优化计算。本研究所有计算均在贵州大学云计算平台上完成。

1.3.2 反应位点预测

对复合物进行几何构型优化，在同样水平下对模板分子（ALA）和功能单体（NIPAM）进行频率计算，得到没有虚频的几何构型，采用Cube＝Potential关键词计算ALA与NIPAM的分子静电势，并预测其活性位点。

1.3.3 结合能的计算

在B3LYP水平下应用6-311++（d，p）基组，首先对ALA、NIPAM分子构型优化和能量进行计算，然后对复合物的构型优化和能量进行计算，最后复合物的结合能通过式（1）计算，基组迭加误差采用Counterpoise方法消除。

式中：∆E为Counterpoise方法校正后的结合能/（kJ/mol）；E（complex）为复合物的总能量/（kJ/mol）；E（ALA）为模板分子ALA的能量/（kJ/mol）；ΣE（NIPAM）为所有单体NIPAM的能量之和/（kJ/mol）。

1.3.4 MIPs的制备

以NIPAM为功能单体，ALA为模板分子，EGDMA为交联剂，AIBN为引发剂，ALA与NIPAM的物质的量之比为1∶2（下同），交联剂与致孔剂参考Yu Cong等[18]利用酰胺基合成MIPs研究中的用量，具体步骤如下：称取0.520 g ALA、0.570 g NIPAM、0.100 g AIBN于25 mL三角瓶中，加15 mL乙腈溶解，加10 g EGDMA混匀，超声脱泡5 min，向三角瓶充氮气5 min，反复超声-浸氮2 次后加塞密封，置于4 ℃生化培养箱中，在365 nm紫外光照射下聚合48 h得到的较硬固体，研磨后过200 目（75 μm）筛，用甲醇-乙酸（9∶1，V/V，下同）洗脱液清洗3 次以除去未反应的单体及其余杂质，然后放入盛有甲醇-乙酸洗脱液的索氏提取器中洗脱模板分子，直到洗脱液中ALA的吸光度小于0.005，将洗脱模板分子后的聚合物于50 ℃干燥24 h后得到ALA-MIPs。非印迹聚合物（non imprinted polymers，NIPs）的制备方法相同，只是不添加模板分子ALA。

1.3.5 SEM观察

对ALA-MIPs和NIPs样品用双面胶带法均匀固定在样品台上，用洗耳球轻轻吹掉没有粘牢的样品，然后进行喷金固定，利用S-3400N SEM对其形貌进行观察。

1.3.6 FT-IR实验

采用KBr压片法：分别将ALA、NIPAM和ALA-MIPs研磨成粉末，50 ℃烘干至质量恒定，将样品与KBr按1∶100（m/m）混合后放在模具中，将模具放在压片机中30 GP压力下保持30 s取出，将制作好的KBr晶片放在红外检测仪上检测。

1.3.7 HPLC条件

色谱柱ZORBAX SB-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm，pH 1.0～8.0），检测器为紫外-可见光检测器，检测波长215 nm，流动相为乙腈-水（用磷酸调pH 3.5，体积比50∶50），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL。

1.3.8 等温吸附实验

分别称取20.0 mg的ALA-MIPs与NIPs置于25 mL的锥形瓶中，分别加入5 mL不同质量浓度（20、40、60、80、100、120、140 mg/L）ALA乙腈溶液，密封后，将其置于恒温振荡器中25 ℃、70 r/min振荡12 h，然后10 000 r/min离心10 min，0.22 μm有机膜过滤后用HPLC测定平衡液中ALA浓度。根据式（2）计算ALA-MIPs的单位吸附量Q，并进行Scatchard作图分析。

式中：Q为ALA-MIPs的单位吸附量/（mg/g）；ρ0为ALA的初始质量浓度/（g/L）；ρ为ALA吸附残液的质量浓度/（g/L）；V为ALA溶液的体积/mL；m为ALA-MIPs质量/g。

1.3.9 吸附特异性实验

分别称取20 mg的ALA-MIPs与NIPs置于25 mL的锥形瓶中，分别加入5 mL ALA、DHLA、PBA乙腈溶液，密封后，将其置于恒温振荡器中25 ℃、70 r/min条件下振荡12 h，然后10 000 r/min离心10 min，0.22 μm有机膜过滤后用HPLC法测定平衡液中ALA的质量浓度。根据式（3）计算印迹因子α值。

式中：QALA-MIPs、QNIPs分别为ALA-MIPs和NIPs对ALA的吸附量/（mg/g）。

2 结果与分析

2.1 以NIPAM为功能单体的ALA-MIPs构建

在MIPs制备中，依据功能单体和模板分子间形成加成物的性质，分子印迹法分为共价印迹法与非共价印迹法[19]。非共价印迹法反应条件温和、模板分子选择范围广，且操作简单，易于实现，因此成为了分子印迹使用最普遍的方法[20]。由于羧基（—COOH）可以作为氢键供体和受体与多种模板分子形成氢键作用，甲基丙烯酸（2-methylacrylic acid，MAA）成为了在非共价印迹法中最常用的功能单体[21]。为了减小非特异性结合和背景离子交互作用对MIPs的影响，非共价印迹法引入不可电离的功能单体，如酰胺。

表1 MAA、AAm和NIPAM的介电常数和偶极矩比较[27]Table 1 Dielectric constants and dipole moments of MAA,AAm and NIPAM[27]

从表1可以看出，丙烯酰胺（acrylamide，AAm）和NIPAM的介电常数与偶极矩明显大于MAA，并根据Hunter[22]计算的酰胺的氢键受体值（β＝8.3）大于羧酸的氢键受体值（β＝5.3），这说明酰胺能比羧酸与模板分子形成更强的氢键。自从Yu Cong等[23-24]首次使用了AAm作为非共价印迹氢键结合功能单体制备MIPs之后，AAm作为功能单体成功印迹了多种模板分子[25]，但是AAm不溶于多数有机溶剂，印迹需要选择极性溶剂，而使用极性溶剂会减弱功能单体和模板分子间的氢键作用。

与AAm作为非共价印迹法功能单体相比，NIPAM是更好的选择，因为亲脂性的异丙基使得NIPAM溶于大多数非极性溶剂，并且二级酰胺是比一级酰胺更强的氢键受体，酰胺基的O或N原子均能与氢键供体形成氢键[26]，这表明以NIPAM为功能单体能提高MIPs的识别特性。Nguyen等[25]的研究表明，与AAm和MAA作为功能单体相比，以NIPAM为功能单体制备的MIPs对模板分子具有更好的选择性能，且能减少非特异性键合。因此选择NIPAM作为实验制备ALA-MIPs的功能单体，ALA-MIPs的制备过程如图2所示。

图2 ALA-MIPs制备示意图Fig. 2 Schematic representation of ALA-MIPs

2.2 模板分子与功能单体反应位点预测

图3 NIPAM（a）和ALA（b）的分子静电势图Fig. 3 Molecular electrostatic potential map of NIPAM (a) and ALA (b)

在B3LYP水平下，采用6-31G+（d）基组模拟计算NIPAM与ALA的分子静电势，由图3可知，NIPAM负电荷区域主要集中在羰基的O原子上，易与亲电试剂的反应失去电子；正电荷区域主要集中在与N原子相连的H原子上，易与亲核试剂反应得到电子。因此NIPAM活性位点主要为羰基的O原子和与N原子相连的H原子。同理，ALA中羧基O原子可以作为质子受体而失去电子，羟基H原子可作为质子给体而得到电子，即ALA活性位点主要为羧基O原子和羟基H原子。

2.3 模板分子与功能单体空间结构优化

在MIPs合成过程中，为了形成具较高特异识别性的聚合物，印迹分子与功能单体比例通常大于1，但过量的功能单体会使MIPs的非特异性吸附增大，选择性降低[28]。

图4 ALA与NIPAM不同比例复合物优化构型图Fig. 4 Models of ALA-NIPAM complexes at different ratios

在B3LYP水平下，采用6-311++（d，p）基组计算ALA与NIPAM在不同比例下的复合物构型及氢键形成见图4，可以看出ALA结构中羧基O原子与羟基H原子为反应位点，ALA中羟基H原子作为电子受体与NIPAM中羧基形成氢键，ALA中羧基作为电子供体与NIPAM中胺基H原子形成氢键，这与分子静电势分析结果一致。氢键键长因氢键强度而不同，由图4可知，ALA与NIPAM在1∶1比例下分子间键长分别为1.710 02 Å（O28…H26—O25）、2.294 17 Å（O24…H32—C31），在1∶2比例下分子间键长分别为1.683 10 Å（O28…H26—O25）、2.064 22 Å（N48—H49…O24），与Needham[29]报道的各类氢键键长相比，形成的复合物分子间键长均在氢键键长范围内，且属于较强氢键。如表2所示，复合物比例1∶2时的结合能的绝对值比复合物物质的量之比为1∶1和1∶3时要大，这是由于1∶2时形成的氢键数目饱和，此时结合能为-349.32 kJ/mol，这表明复合物比例1∶2时印迹分子与功能单体可望形成更稳定的复合物，结合能的计算与复合物模型通过氢键预测复合物稳定性结论一致。

表2 在B3LYP/6-311（d，p）水平下模拟计算的复合物结合能Table 2 Binding energies of complexes calculated at the B3LYP/6-311(d, p) level

表2 在B3LYP/6-311（d，p）水平下模拟计算的复合物结合能Table 2 Binding energies of complexes calculated at the B3LYP/6-311(d, p) level

注：—.无结合能项目。

校正后∆E/（kJ/mol）ALA -3.308 8×106 — —NIPAM -9.591 0×105 — —ALA-NIPAM复合物（1∶1） -4.268 2×106 -240.30 -237.86 ALA-NIPAM复合物（1∶2） -5.227 4×106 -349.32 -345.86 ALA-NIPAM复合物（1∶3） -6.186 5×106 -312.12 -306.52分子 E/（kJ/mol） 校正前∆E/（kJ/mol）

2.4 ALA-MIPs形貌分析

图5 NIPs（a）和ALA-MIPs（b）的SEM照片Fig. 5 SEM images of NIPs (a) and ALA-MIPs (b)

MIPs的分散程度、粒径大小及排列等表面形貌可以使用SEM观察[30]，图5为NIPs和ALA-MIPs的SEM照片，可以看出NIPs表面呈现不规则的、松散的块状，有较严重的团聚现象；ALA-MIPs表面则呈现相对规则的多孔状，可以看出其具有较多的三维空穴，这种三维空穴有利于底物与结合位点接触，提高其对印迹分子的结合量。

2.5 ALA-MIPs红外光谱分析

利用红外光谱中红外吸收带的波长的变化可以分析MIPs中印迹分子与功能单体结合过程中基团的变化及结合位点的位置[31]。ALA结构中特征吸收峰主要是1 690 cm-1处的C＝O伸缩振动和3 000 cm-1左右的-OH伸缩振动，其特征峰除此之外还有在2 700 cm-1左右由伸缩振动和变形振动的倍频及组合频引起的吸收峰以及920 cm-1处的弯曲振动吸收峰；而NIPAM的特征峰主要是1 650 cm-1左右二级酰胺中C＝O伸缩振动峰和3 350 cm-1左右N-H的弯曲振动峰。

由图6可以看出，ALA-MIPs中酰胺的1 650 cm-1处C＝O伸缩振动和3 350 cm-1处N-H弯曲振动明显减弱，并且羧基中-OH的2 728 cm-1伸缩振动峰几乎被掩盖，1 690 cm-1处羧酸C＝O伸缩振动峰向高波数1 717 cm-1处移动，这说明ALA羧基中-OH和NIPAM中酰胺的N-H的特征吸收光谱受到屏蔽，即制备得到的固体ALA-MIPs中ALA与NIPAM结合位点形成，结果与ALA和NIPAM自组装体系理论分析一致。

图6 ALA、NIPAM和ALA-MIPs的FT-IR谱图Fig. 6 FT-IR spectra of ALA, NIPAM and ALA-MIPs

2.6 ALA-MIPs吸附性研究

2.6.1 等温吸附性能

图7 ALA-MIPs和NIPs的等温吸附曲线Fig. 7 Adsorption isotherms of ALA-MIPs and NIPs

通过静态平衡吸附法得到ALA在20～160 mg/L范围内的等温吸附线如图7所示，可以看出在ALA初始质量浓度低于120 mg/L时，ALA-MIPs的等温吸附曲线呈直线上升趋势，对ALA的吸附量（Q）增加较快，之后ALA-MIPs对ALA的吸附量增加缓慢，这说明ALA-MIPs中对ALA的结合位点基本达到吸附饱和。而NIPs的等温吸附曲线在ALA初始质量浓度低于100 mg/L时，对ALA的吸附量增加较快，之后NIPs对ALA的吸附量趋近平衡，当吸附量趋近平衡，NIPs的吸附容量比ALA-MIPs小。

在MIPs的吸附性能研究中经常使用Scatchard模型（式（4））来评价MIPs对模板分子的结合特性[32]。

式中：Q为各浓度下的平衡吸附量/（mg/g）；Qmax为饱和吸附量/（mg/g）；ρ为ALA平衡质量浓度/（g/L）；Kd为平衡解离常数/（mol/L）。

图8 ALA-MIPs和NIPs对ALA的等温吸附Scatchard分析图Fig. 8 Scatchard plot analysis of the binding of ALA to ALA-MIPs and NIPs

Scatchard作图法进行分析，以Q/ρ对Q作图（图8），可以看出NIPs的吸附结合位点呈线性关系，可以用一条直线进行较好的拟合，说明NIPs对ALA的结合只存在一类结合位点；而ALA-MIPs的吸附结合位点呈非线性关系的，可以由两条直线进行较好的拟合，这说明ALAMIPs中存在两类不同的结合位点，即高亲和力位点和低亲和力位点，这是因为ALA-MIPs中模板分子与功能单体的自组装过程中存在两类不同的结合方式，因此形成两类不同亲和力的结合位点[33]，这与理论计算得到模板分子与功能单体自组装可以形成两种不同比例的复合物的结论一致。分别从图8中两段线性部分拟合方程的斜率和截距可以得出，ALA-MIPs的高亲和力位点平衡解离常数和最大吸附量分别为6.969 7×10-5mol/L、12.145 mg/g；低亲和力位点平衡解离常数和最大吸附量分别为1.558 5×10-5mol/L、104.06 mg/g。

2.6.2 吸附特异性分析

图9 ALA-MIPs和NIPs对ALA及其类似物的饱和吸附量Fig. 9 Adsorption of ALA-MIPs and NIPs for ALA and analogues

如图9所示，ALA-MIPs对模板ALA吸附量较高，而对DHLA、PBA的吸附量明显较ALA的吸附量低，比NIPs的吸附量大，这主要是因为尽管ALA、DHLA和PBA分子均含有能与功能单体酰胺基团的氧原子或氢原子形成氢键的羧基，但由于MIPs印迹孔穴的空间位阻的存在，使得ALA结构类似物不能像ALA一样，与印迹孔穴中特定的空间结合位点形成较强的作用力，这表明ALA-MIPs对ALA的吸附具有特异选择性。

MIPs的特异选择性一般用印迹因子α表示[34]，α值越大说明特异性越强，印迹效果越好，根据式（2）计算得ALA、DHLA和PBA的α值分别为2.017、1.207和1.119。从α值也可以看出，实验制备的ALA-MIPs具有较好选择性，在一定范围内可以对ALA选择性吸附。

3 结 论

利用密度泛函理论在B3LYP水平下模拟计算了模板分子ALA与功能单体NIPAM形成复合物的构型和成键情况，优化了功能单体NIPAM与模板分子ALA间的印迹比例，以理论计算优化的印迹比例制备了ALA-MIPs，并对ALA-MIPs进行了微观形貌、结构和吸附性研究，结果有望为分子印迹技术在天然抗氧化剂硫辛酸的富集和分离方法中的应用提供理论依据。

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