紫外线等离子体复合诱变解淀粉芽孢杆菌提高NAG 产量

黎恒，张琳，陈红爽，张孟阳，黄娟，张岚，王德培

（工业发酵微生物教育部重点实验室，省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的乙酰化衍生物，是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，其在治疗关节炎、抑制肿瘤和抗氧化等方面有明显效果，被广泛应用于医疗、化妆品以及食品行业[1-3]，市场需求巨大。目前生产NAG的方法主要是甲壳素酸水解法[4]和化学合成法[5]，但因环境污染巨大以及存在过敏风险等因素，安全环保且生产周期短的微生物发酵法开始被关注和研究。而采用微生物发酵法生产NAG，关键在于菌株，目前国内外研究方向主要是一些霉菌、大肠杆菌及芽孢杆菌，其发酵产量均不太理想[6-8]，因此通过分子改造或诱变选育来筛选高产菌株具有非常重要的意义。

等离子体诱变是近年来发展迅速的一种物理诱变手段，由自由基、带电粒子、中性粒子、光子等多种离子组成的等离子束作用于目标菌株，具有高突变率和突变株遗传稳定性良好的特点，被广泛地应用于菌种诱变[9]。与分子手段相比，等离子体诱变育种具有操作简便、安全无毒、低成本的优点[10]。多功能等离子体诱变 系 统 （multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）作为一种新一代微生物诱变平台，以等离子体诱变为主，可与紫外、化学诱变等多种手段结合，又再次提高了突变率和突变类型[11]。本试验首次采用等离子体-紫外复合诱变，对解淀粉芽孢杆菌BI2进行诱变，通过对复合诱变条件的探究，以期来提高BI2产NAG的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢杆菌BI2（Bacillus amyloliquefaciens BI2）由天津科技大学生化过程与技术研究室自秸秆饲料中分离得到，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.3413。

1.1.2 试剂

无水葡萄糖、氯化钠、（NH4）2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4（分析纯）：博欧特（天津）化工贸易有限公司；酵母粉、蛋白胨、琼脂、甘油（分析纯）：北京奥博星生物科技有限公司；谷氨酸钠（纯度≥99%）：天津市红玫瑰食品有限公司；NAG标品（纯度≥99%）：美国Sigma公司。

1.1.3 培养基

细菌基础培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10g/L，琼脂 1.5%；pH7.0～7.2；灭菌121℃，15min。

种子培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉20 g/L，氯化钠 5 g/L；pH 7.0～7.2；灭菌 115 ℃，20 min。

发酵培养基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，氯化钠 5 g/L，（NH4）2SO45 g/L，谷氨酸钠 20 g/L，K2HPO4·3H2O 10 g/L，KH2PO45 g/L；pH7.5；灭菌 115 ℃，20 min。

葡萄糖筛选培养基：葡萄糖300g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母粉 0.5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂 1.5%；pH 7.0～7.2；灭菌115℃，20 min。

1.2 仪器与设备

Mandela型多功能等离子体诱变系统（MPMS）：北京艾德豪克仪器生物有限公司；Agilent 1200高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；TU-1810紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LRH-250A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；三层立式多功能摇床：上海旻泉仪器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

种子培养：从斜面/平板挑取一环单菌落菌体接种到含有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于摇床中250 r/min，34℃培养16 h。

发酵培养：将活化好的种子液，以4%（体积分数）的接种量接种到含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，于摇床中200 r/min，37℃发酵48 h。

诱变前菌体培养：取活化好的种子液，以4%（体积分数）的接种量接种到含有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于摇床中250 r/min，34℃培养10 h，使菌体处于对数生长的中期，镜检无芽孢。

1.3.2 菌株的诱变

菌悬液的制备：取1 mL诱变前菌体培养液12 000 r/min离心2 min，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤3次，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，稀释100倍，使细胞的终浓度为1×107个/mL。

等离子体诱变：取上述菌悬液10 μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统（multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）中进行等离子体诱变，以99%的氮气作为工作气体，输入功率120 W，间距10 mm，气流量10 L/min，分别诱变时长 5、7、10、15、20、30、50 s来考察致死率及正突变率。

紫外诱变：取上述菌悬液10 μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统（MPMS）中进行紫外诱变，紫外线灯管功率为20 W（提前预热 20 min），处理距离 25 mm，处理时间 5、7、10、15、20、30、50 s来考察致死率及正突变率。

等离子体-紫外复合诱变：取上述菌悬液10 μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统（MPMS），先等离子体诱变处理一定时间，紧接着进行紫外诱变。考察致死率及正突变率。

1.3.3 筛选方法

诱变初筛：在诱变处理后的诱变杯中加入1 mL生理盐水将菌种洗下制成菌悬液。稀释10倍后，取100 μL均匀涂到高糖筛选培养基表面，37℃静置培养24 h，挑选菌落直径≥3 mm的菌株。

诱变复筛：将保藏的初筛菌种接于液体种子培养基中，于摇床中250 r/min，34℃培养16 h，活化2次后以4%（体积比）的接种量接于发酵培养基中，于摇床中200 r/min，37℃培养48 h，采用高效液相色谱法分析乙酰氨糖产量，将高产菌株保存于20%（体积比）甘油管中-20℃保藏。

1.3.4 分析方法

致死率的计算：对诱变处理过的样品在适当的稀释度下涂板LB平板，通过菌落形成单位（colonyforming units，CFU）来计算其致死率，并获得致死率曲线。

致死率/%=（对照板菌落数-诱变板菌落数）/对照板菌落数×100

正突变率的计算：挑取葡萄糖筛选平板上菌落直径≥3 mm的菌株，进行摇瓶复筛，以NAG产量较出发菌（BI2）提高20%的菌株统计为正突变株。

正突变率/%=正突变菌落数/葡萄糖筛选平板总菌数×100

NAG检测方法：发酵液经离心、稀释后由Agilent 1200高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测[12]，色谱柱 HPX-87H（Bio-Rad），流动相5 mmol/L H2SO4，检测器示差折光检测器，柱温 60 ℃，流速 0.6 mL/min，进样量 10 μL。

2 结果与分析

2.1 初筛方法的建立

本试验所用菌株BI2在葡萄糖耐受试验中表现出高耐受性，在300 g/L葡萄糖浓度的平板培养下，依旧保持了30%的存活率，比较适合高糖高渗的工业化生产。且在高糖平板上其菌落直径发生了较大改变，对菌落直径大小进行统计，如表1所示。

表1 葡萄糖筛选平板菌落大小分布Table 1 The distribution of colony size on glucose screening plate

由表1可知，菌落直径大小呈正态分布，菌落直径≥3 mm的占10%，菌落直径≤1.5 mm的菌落占20%，1.5 mm～3 mm的菌落占70%。对不同直径菌落各取30个进行摇瓶发酵验证NAG产量，并与出发菌株对照，如表2所示。

表2 葡萄糖筛选平板菌落大小与NAG产量Table 2 NAG yeild with different colony sizes of strains on glucose screening plate

由表2可知，发现在高糖平板上菌落直径大小与NAG产量呈正相关性，既菌落直径越大其NAG产量越高，其在300 g/L葡萄糖高渗平板上长势越好，因为NAG与芽孢菌细胞壁合成有关，NAG产量越高，芽孢菌细胞壁越完整[13]。因此，本试验选择了葡萄糖筛选培养基并挑选菌落直径≥3 mm的菌株，来作为初筛条件快速筛选NAG产量提高菌株。

2.2 等离子体诱变对菌株致死率及正突变率的影响

MPMS产生的等离子体中含有氮正离子（N+）、原子态氧（O）、OH-自由基等活性成分，可使微生物的细胞壁、细胞膜的结构及通透性改变，并对DNA和蛋白质等生物大分子造成损伤，导致大量细胞死亡。少量存活细胞通过修复机制，产生大量随机突变[14]。因此，选择合适的MPMS诱变时间能够实现微生物的快速诱变育种。

本试验先对出发菌株BI2进行等离子体单独诱变。测定其致死率曲线见图1。

图1 等离子体诱变对菌株致死率和正突变率的影响Fig.1 The effect of MPMS treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由图1可知，多功能等离子体诱变系统对BI2的致死力较强，MPMS处理20 s时致死率达到91%，处理50 s时致死率达到98%。有研究表明，当微生物菌种的致死率为80%～95%时[15]，正突变率最高，但突变本身具有随机性，其致死率与正突变率之间的关系并不是十分清楚，主要取决于诱变方法和菌株本身的特性。因此选取致死率在79%～96%之间的5个点测定其正突变率，如图1显示，结果表明等离子体处理15 s时正突变率最高，为15%，此时致死率为88%。

2.3 紫外诱变对菌株致死率及正突变率的影响

出发菌株经紫外诱变处理不同时间的致死率和正突变率如图2所示。

图2 紫外诱变对菌株的致死率和正突变率影响Fig.2 The effect of Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由图2可以看出，出发菌株对紫外处理也比较敏感，随着处理时间的延长，致死率逐渐增加。当处理10 s时，致死率为57%，当处理30 s时，致死率为95%，处理50 s时致死率为100%。有文献表明，紫外处理致死率在70%～80%之间时正突变率较高[16]。因此选取致死率在60%～95%之间的5个点进行正突变率测定。结果显示，当紫外线处理20 s时，正突变率最高为10%，此时致死率为84%。

2.4 等离子体-紫外复合诱变对菌株致死率和正突变率的影响

复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用、同时使用、同一诱变剂的重复使用。普遍认为复合诱变具有协同效应。单一诱变因子长期使用容易使菌株产生耐受性，两种或两种以上诱变剂合理搭配进行复合诱变较单一诱变效果更好[17]。本试验采用先等离子体后紫外处理的复合诱变顺序，主要考虑两种方法的处理时间对菌株诱变效果的影响。依次选取两种方法正突变率最高的3个水平设计了全面实验，探究复合诱变对菌株的致死率及正突变率影响。结果如表3所示。

由表3分析可知，在复合诱变中，随着复合诱变时间的增加，致死率也随之增加，但正突变率却不一定随之增加，说明两种诱变因子存在协同和交互作用。而当致死率过高时，正突变率显著下降。其中等离子体处理15 s，然后紫外处理15 s时正突变率最高为28%，此时致死率为92%。可以看到复合诱变较单因子诱变的正突变率提高明显，较等离子体单独处理提高1.86倍，较紫外单独处理提高2.8倍。

表3 等离子体-紫外复合诱变对菌株的致死率和正突变率影响Table 3 The effect of MPMS-Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

2.5 等离子体-紫外复合诱变的筛选结果

取等离子体处理15 s和紫外处理15 s的复合诱变后的菌悬液，按照1.3.3的方法进行高浓度葡萄糖平板初筛，统计菌落直径≥3 mm的占全部菌落的比例达到35%比出发10%有较大提高。由于在葡萄糖筛选平板上菌落大小与产NAG能力有正相关性，说明经复合诱变作用后，突变株的正突变率明显提高，挑取40株按照1.3.3的方法进行复筛，NAG产量见图3所示。

由图3可知，直径≥3 mm的菌株中，80%的菌株发生了正突变，证明了初筛方法的有效性。从中筛选出一株NAG产量最高菌BH-7，NAG产量达到1.02 g/L，较出发菌提高3.4倍。经过两次复合诱变及筛选，分别筛选出 BH-14、BH-2-1、BH-3-2，NAG 产量依次为1.11、1.4、1.23 g/L，较出发菌分别提高 3.7、4.7、4.1 倍。

2.6 突变菌的遗传稳定性研究

为考察突变株的遗传稳定性，将经过筛选到的四株产量提高菌（BH-7、BH-14、BH-2-1、BH-3-2）在 LB平板培养基中传代培养10代，并将各代菌体分别经种子活化后接种于发酵培养基中，37℃培养48 h，通过高效液相色谱法测定NAG产量，如图4所示。

由图4可知，菌株BH-7、BH-14、BH-2-1在传代后NAG产量下降明显，遗传不稳定。菌株BH-3-2在第3、4代产量略有下降，很快产量回复且遗传比较稳定。

图3 复合诱变突变株NAG产量Fig.3 NAG production of the mutants on MPMS-Ultraviolet treatment

图4 突变株的遗传稳定性实验Fig.4 Genetic stability experiment of the mutant strains

3 结论

本文研究了等离子体、紫外以及等离子体-紫外复合诱变对芽孢菌致死率及正突变率的影响，对结果进行分析表明，等离子体诱变15 s时正突变率最高为15%，紫外诱变20 s时正突变率最高为10%，而在等离子体15 s和紫外15 s的复合诱变条件下，正突变率达到最高为28%，较单因子诱变效果提高明显，可以作为诱变育种的首选方法。在该复合诱变条件下，通过初筛复筛，筛选出一株产量提高菌株BH-3-2。与出发菌株BI2相比，NAG产量从0.3 g/L提高到1.23 g/L，提高了4.1倍，传代10次发现遗传稳定性良好。

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