过表达SOX6基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响及其机制

刘恩令，周玉秀，王立群，李君，陈梅，张冬红，蔡朝辉，陈俊臣

(河北医科大学附属唐山市工人医院，河北唐山063000)

SOX6属于SRY相关基因家族，该家族能够编码一系列转录因子，其共同特点是具有保守的HMG-box DNA结合域[1]。有研究表明，SOX6基因异常表达参与多种肿瘤的发生、发展[2,3]。但SOX6基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响鲜见报道。2018年1月，本研究采用特异性质粒转染卵巢癌SKOV3细胞，挑选稳定过表达SOX6基因的细胞，检测该细胞增殖、凋亡情况，探讨SOX6基因在卵巢癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3细胞株购于美国ATCC公司。Edu增殖试剂盒、Hoechst33342试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自日本东仁公司，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、PTEN及β-actin抗体均购自美国CST公司。酶标仪购自美国Thermo公司，荧光显微镜购自Becton Dickinson公司，INTERFERINGTM转染试剂购自法国Polyplus Transfection公司，特异性overexpression序列及其阴性对照序列、重组质粒pcDNA3.1-SOX7及其阴性空载体pc-DNA3.1-mock购自上海生工科技公司，cDNA反转录酶试剂盒购自日本TaKaRa公司，RPMI 1640培养基购自Hyclone公司。

1.2 过表达SOX6基因的SKOV3细胞模型构建 SKOV3细胞培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中，每孔2×105个细胞。培养基中常规加入100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素，培养温度为37 ℃。挑选生长良好的细胞随机分为实验组及对照组，每组3个复孔，分别转染pcDNA3.1-SOX7及pc-DNA3.1-mock。转染48 h后采用荧光定量PCR法检测SOX6表达，结果显示，实验组及对照组SOX6 mRNA相对表达量分别为(353.3±27.3)%、(100.0±2.1)%，实验组高于对照组(P<0.05)。提示过表达SOX6基因的SKOV3细胞模型构建成功。

1.3 过表达SOX6基因的SKOV3细胞相关指标观察

1.3.1 细胞活性 将两组细胞以1×104个/孔接种于96孔板，置于细胞培养箱中培养72 h。将100 μL新鲜培养基与10 μL CCK-8试剂混合并加入各孔。将96孔板置于37 ℃孵育1 h，采用酶标仪测定450 nm波长处的光密度(OD)值。

1.3.2 细胞增殖情况 采用Edu荧光染色法。取两组对数生长期细胞，以4 000个/孔接种于96孔板中，培养至对数生长期。用细胞培养基按1 000∶1的比例稀释 Edu 溶液(试剂A)，制备适量50 μmol/L的Edu培养基，每孔加入100 μL 50 μmol/L的Edu培养基孵育1 h，弃培养基，PBS清洗细胞 1～2次，每次5 min，每孔加入100 μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)，室温孵育30 min；每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5 min，弃甘氨酸溶液，每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5 min，弃PBS，每孔加入100 μL渗透剂(含0.5%Triton X-100的PBS)，脱色摇床孵育 10 min，PBS清洗 1次，每孔加入100 μL 1 mg/mL DAPI，避光、室温、脱色摇床孵育10 min，PBS 清洗1～3次。染色完成后，荧光显微镜(×100)下随机取5个视野，计数总细胞数及Edu染色阳性细胞数，计算细胞增殖率。细胞增殖率=Edu染色阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3.3 细胞凋亡情况 采用Hoechst法。将两组细胞接种于事先放有载玻片的培养板中，在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗，15～25 ℃条件下置于新配制的4%多聚甲醛中固定1 h。PBS洗3遍，将制备好的玻片浸泡在装有Hoechst33342染液的染色缸中，避光作用10 min；荧光显微镜(×100)下选用340 nm的激发光观察，活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。如果观察到≥3个DNA荧光碎片判定为凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.3.4 PTEN、Akt及p-Akt蛋白表达 采用Western blotting法。将两组细胞用RIPA裂解，提取细胞总蛋白，12% SDS-PAGE电泳后转到聚偏氟乙烯膜上，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入特异性PTEN、Akt、p-Akt、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室温下孵育1 h，采用ECL化学发光和曝光显影。其中一抗有效浓度为1∶1 000～1∶2 000。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参β-actin蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞活性比较 实验组及对照组OD450值分别为2.1±0.1、4.3±0.5，组间比较P<0.05。

2.2 两组细胞增殖率比较 实验组及对照组细胞增殖率分别为(13.2±2.2)%、(43.3±4.2)%，组间比较P<0.05。

2.3 两组细胞凋亡率比较 实验组及对照组细胞凋亡率分别为(15.2±3.2)%、(5.2±1.4)%，组间比较P<0.05。

2.4 两组PTEN、Akt及p-Akt蛋白表达比较 与对照组比较，实验组PTEN蛋白表达增加，p-Akt蛋白表达降低，组间比较P均<0.05。见表1。

表1 两组PTEN、Akt及p-Akt蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

SOX家族是一类高度保守的HMG结构域，其编码的蛋白广泛参与性别决定、调节胚胎神经系统发育、软骨形成、血细胞生成、晶状体发育等多脏器分化，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[4]。SOX6是SOX基因家族的一个重要成员。有研究表明，抑制SOX6基因表达能够促使脑干细胞朝胶质瘤样细胞分化[2]；SOX6参与多种肿瘤的发生、发展，在肝癌组织中SOX6表现为抑癌基因作用[3,5]。SOX6表达增加能显著抑制食管癌细胞增殖[6]；能够通过抑制胰腺癌细胞表皮间质化过程，同时感染Akt信号通路，从而降低细胞侵袭力[7]。与瘤旁正常组织相比，SOX6在骨肉瘤组织中低表达，通过下调TWIST1表达抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭及表皮间质化过程[8]。SOX6还可抑制前列腺癌、直肠癌细胞增殖[9,10]。但是，SOX6与卵巢癌的关系目前尚未明确。本研究结果显示，特异性重组质粒pcDNA3.1-SOX6可增加 SKOV3细胞SOX6基因表达，过表达SOX6的SKOV3细胞活性下降，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高。证实过表达SOX6可显著抑制卵巢癌SKOV3细胞活性及其增殖，并可促进细胞凋亡。SOX6在卵巢癌中的作用与上述研究中的结果相一致。

研究证实，PTEN/Akt信号通路广泛参与肿瘤细胞的增殖、分化、转移等多个过程，在多数恶性肿瘤中，PTEN表达均被抑制，从而导致PI3K/Akt持续激活，如在乳腺癌中PTEN蛋白表达抑制导致Akt蛋白持续磷酸化，进而参与肿瘤的发生、发展[11～14]。PTEN/Akt通路激活可抑制卵巢癌细胞增殖[11]，而抑制该通路则促进卵巢癌细胞增殖[15]。本研究采用Western blotting法检测PTEN/Akt信号通路的关键蛋白PTEN、Akt及p-Akt，首次证实在卵巢癌SKOV3细胞中过表达SOX6基因能够显著促进PTEN蛋白表达，Akt蛋白表达无变化，磷酸化的Akt蛋白表达降低，说明PTEN/Akt信号通路参与了SOX6基因过表达对SKOV3细胞增殖及凋亡影响的过程，而是否有其他信号通路参与该过程则有待更进一步研究。

综上所述，过表达SOX6基因能够抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进细胞凋亡，其机制可能与抑制PTEN/Akt细胞信号通路激活有关。

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