多发性硬化患者Th17转录因子及相关细胞因子表达的研究☆

傅增辉 姜岩○☆ 刘晶 秦迎辉 金艳 张广萍

Th17细胞是近年来发现的一种新型CD4+效应性T细胞，通过分泌IL-17等前炎症因子，在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用[1]。研究证实，Th17转录因子RORγt和BATF在多种自身免疫疾病中发挥重要的调控作用[2]。本研究以MS患者为研究对象，通过检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC） 中 BATF、RORγtmRNA的表达水平和Th17细胞 （CD4+IL-17+）百分率，以及血清中Th17相关细胞因子表达水平，以期阐明Th17及其相关因子在MS发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集齐齐哈尔医学院附属第三医院和齐齐哈尔市第一医院2013年1月至2017年3月神经内科确诊为急性发作期的复发-缓解型多发性硬化患者作为研究对象，纳入标准：①符合2010年McDonald诊断标准及 《多发性硬化诊断和治疗中国专家共识(2014版)》诊断标准[3-4]，且为缓解-复发型多发性硬化急性发作期，且出现神经功能恶化、发作出现在2周以内；②治疗后症状明显减轻，EDSS减少＞1分。排除标准：①假性复发；②入院前3个月内接受免疫调节治疗的患者 （包括激素、环磷酞胺等免疫抑制剂或重组人干扰素治疗）；③合并其他免疫相关疾病，如系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等患者；④合并颅内外感染，如脑炎、脑膜炎等患者；⑤卒中患者。选取本院体检中心与病例组在性别、年龄相匹配的健康人为对照组。本研究经医院伦理委员会的批准并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 收集研究对象吸烟史、饮酒史、高血压史和冠心病史等。病例组急性发作期MS入院后均给予甲基泼尼松龙1000 mg/d，3 d后减至500 mg，每3 d减一半减至40 mg时改为口服，每周减4 mg至减完，及营养神经（如甲钴胺、维生素B1）和对症治疗等。

1.3 标本采集 所有研究对象均于清晨空腹采肘静脉血10 mL（肝素钠抗凝），室温静置30 min后，4℃、1500 r/min离心10 min，取血清，置于-70℃保存，用于后续细胞因子的检测。Ficoll密度梯度离心后分离PBMC，用于后续提取RNA及流式细胞术检测百分率。

1.4 ELISA 法检测血清中IL-10、IL-17和IL-27表达水平 严格按照ELISA试剂盒 （德国Qiagen公司生产）说明书操作，检测血清中IL-10、IL-17和IL-27表达水平。每个样本和标准品均设2个复孔，测定各孔在492 nm处的吸光度（A）值。根据标准曲线计算出样品浓度，IL-10、IL-17和IL-27表达水平均以ng/L为单位表示。

1.5 实时荧光定量PCR(RT-PCR)RNA表达水平采用Trizol法提取PBMC中总RNA，使用Prime-Script TM RT Reagent Kit试剂盒 （大连宝生公司生产）逆转录为cDNA，使用SYBROR Premix Ex Taq TM试剂盒进行RT-PCR（上海生工公司生产），严格执行说明书操作，检测 RORγt和 BATF mRNA表达水平。记录反应后的CT值，采用2-ΔΔCT法计算mRNA表达水平。所需引物见表1。

1.6 流式细胞术检测外周血PBMC中Th17细胞百分率 取PBMC悬液加入6孔板中，加入前脂肪细胞培养基（PMA）（20 μg/L），于细胞培养箱中培养4 h（37℃、5%CO2）。收集细胞分为同型对照管和试验管，加入PE-cy5抗人CD4+mAB（上海生工公司生产）后避光孵育30 min，弃上清，多聚甲醛固定，用皂素穿膜。试验管加入PE抗人IL-17mAB（上海生工公司生产），同型对照组加入同型对照抗体，避光孵育1 h，洗涤液重悬细胞，上流式细胞仪检测。以CD4直条图设门区分出CD4+细胞，以散点图表示IL-17+细胞，用Cellquest软件获取并分析数据，计算Th17细胞百分率。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。定量资料采用±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，定性数据用率表示，组间比较采用 χ2检验。 检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料 病例组女39例，男14例；年龄23～51 岁，平均为（36.19±11.37）岁；病程 1.0～11.5 年，平均（4.34±5.17）年；EDSS 评分 1～7.01 分，平均（3.67±2.39）分。 对照组 53例，女 39例，男 14例，年龄 24～51 岁，平均为（36.57±11.07）岁。 两组间一般资料进行比较，差异均不具有统计学意义（均P＞0.05）（见表 2）。

表1 所需引物序列

表2 病例组与健康对照组一般资料

2.2相关细胞因子及Th17细胞百分率 与健康对照组比较，MS患者治疗前血浆IL-17水平较高，而IL-10、IL-27水平均较低，外周血 PBMC中BATF和RORγt mRNA表达水平均升高，Th17细胞 （CD4+IL-17+细胞）百分率明显升高 （均P＜0.05）；与治疗前比较，MS患者治疗4周后血浆IL-17水平降低，相反IL-10、IL-27水平均升高，BATF和RORγt mRNA表达水平均降低，Th17细胞 （CD4+IL-17+细胞）百分率明显降低 （均P＜0.05）；治疗后与健康对照组比较，IL-10与IL-17仍偏高 （均P＜0.05）， 而 IL-27 偏低 （P＜0.05），BATF和RORγt mRNA表达水平均升高，Th17细胞（CD4+IL-17+细胞）百分率明显升高（均P＜0.05）（见表 3）。

3 讨论

多发性硬化是最常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病，是一种自身免疫性疾病，中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为其主要病理特点，病灶的空间多发性和时间多发性为其主要临床特点[5]。目前MS的病因及发病机制尚不明确，但已有研究证实，在MS的发病和病情进展中CD4+T细胞起着重要的介导作用[6]。

Th17细胞是近年来新发现的一群效应性CD4+T 细胞，主要分泌 IL-17A（即 IL-17）、IL-17F、IL-22和TNF-α等前炎症因子发挥促炎作用[6]。目前发现MS发病机制主要由Th1、Th17细胞参与致病，同时调节T细胞、APC等细胞通过细胞因子参与致病[7]。细胞因子异常在自身免疫疾病中起到重要作用。IL-17、IL-27分别主要由Th17、APC细胞分泌，研究发现，在MS发病中IL-17具有促炎作用，而IL-10和IL-27具有广泛抑制作用，尤其IL-27对Th1、Th17细胞具有明显抑制作用[8]。IL-10主要通过抑制抗原呈递细胞向CD4+Th1递呈抗原，使CD4+Th1增殖受阻，从而发挥其免疫抑制作用[9]。在本研究中病例组治疗前较对照组IL-17水平较高，而IL-10、IL-27水平均较低，Th17细胞百分率较高，经治疗后IL-17及Th17细胞百分率水平回落，相反IL-10、IL-27水平均升高，与既往研究相同。病例组治疗后与对照组对比，除IL-10外均有明显差异，而IL-10水平与健康组无显著差异。SOLDAN等[10]研究发现，在MS患者体内IL-10分泌与表达呈持续性降低，提示IL-10是一种免疫抑制因子，有助于MS患者减轻疾病症状。考虑IL-10与MS的病情加重有关，病情缓解而IL-10水平恢复。

表3 各组研究对象血清中IL-10、IL-17、IL-27和PBMC中BATF、RORγt mRNA相对表达水平及Th17细胞百分率

RORγt是诱导Th17细胞产生及分化的关键转录因子，能诱导初始T细胞分化成Th17细胞，作用类似于T-bet对Th1，或者GATA3对Th2细胞的作用，是Thl7细胞特异性的转录调节因子。RORγt过表达促进Th17的分化及IL-17的分泌，而RORγt缺失则Th17分化量及IL-17的浓度显著下降[11]。BATE是碱性亮氨酸拉链转录因子激活蛋白1(AP-1)超家族中的一员，仅有DNA结合区而缺乏转录激活区，被认为是活化蛋白-1家族的负调控因子。研究证实，BATF缺陷小鼠Th17细胞分化受阻，对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)完全抵抗[12]。同时有研究发现体外培养的BATF-/-CD4+和CD8+T细胞，不能产生Th17分化所需的关键转录因子RORγt，即使引入大量过表达的RORγt也不能完全恢复IL-17的表达[13-14]。MAR TINET等[15]研究不仅表明BATE对Th17细胞分化具有正向调节作用，还进一步提示这种调节机制与BATF通过结合IL-17基因启动子及增强Th17特异性转录因子RORγt的表达有关。在本研究中，病例组治疗前 IL-17、BATF、RORγt和 Th17 细胞均呈现高水平，而治疗后IL-17、BATF、RORγt和Th17细胞均降低，考虑其均与MS发病相关。

本研究发现BATF、RORγt可能通过共同调控Th17的分化，从而促进Th17细胞及其细胞因子IL-17的高表达，间接活化和募集中性趋化因子IL-10和IL-27，促使MS的发生与进展，其作用的确切机理还有待进一步的研究；而检测转录因子RORγt和BATF及其相关细胞因子可能对MS的诊断及预后判断具有一定的临床意义，也为MS的个性化治疗提供了潜在的新靶标。在后续研究中，将进行更大样本，更深入地研究，推动其在临床中的应用。

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