六安市2010至2015年流感病原学检测及流行病学分析

姜正好 杨 卫 张 凤 高大维 常宏伟

流感是由流感病毒引的一种急性呼吸道传染病，能引起广泛流行的流感病毒主要为A型和B型[1]。由于流感病毒感染人群较广，潜伏期短，通过空气飞沫传播，因而极易引起流行，是第一个进行全球监测的传染病[2]，六安市于2009年开展流感病毒核酸检测工作，并加入了国家流感监测网。由于流感病毒表面抗原易发生变异，人群对变异株普遍易感，控制难度大，每年都有不同的流感亚型在某一地区流行。本文通过六安市2010～2015年流感监测数据，从流感核酸检测、流感亚型流行、流感时间分布、年龄性别分布等方面进行分析，进一步掌握流感病毒的活动规律及流行特征，以便有效控制流感的暴发和流行。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月至2015年12月中国疾病预防控制系统“中国流感信息系统”流感监测数据中六安市15 435 流感样病例(influenza-like illness，ILI)资料，其中采样检测的咽拭子标本3 890份。按照《全国流感监测方案(2010年版)》[3]选取六安市人民医院(哨点医院)发病3 d内的ILI咽拭子标本，每周随机采集5份以上咽拭子标本放入含3～5 mL病毒采样液中，于4℃保存，并于48 h内运送至市疾控中心流感网络实验室，进行核酸检测和/或病毒分离。纳入标准：患者体温≥38℃，伴有咳嗽或咽痛，缺乏其他实验室确诊依据。

1.2 设备试剂 采用德国产QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)试剂提取流感病毒核酸,反应体系采用QIAgen one-step RT-PCR Kit (Cat.no.210212)。试剂包括Goldview DNA 核酸染料(北京赛百盛基因技术有限公司生产)，6×上样缓冲液和DL 2 000DNA Mark[宝生物工程有限公司(大连)生产]。引物序列由安徽省疾控中心提供, 并由上海生物工程技术服务有限公司合成。核酸扩增仪 2720和荧光PCR仪7500 fast 均由AB公司生产，电泳仪(北京六一厂生产)，全自动凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad生产)。

1.3 检测方法 2013年4月之前的标本用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法，对采集ILI的咽拭子标本，提取流感病毒核酸后扩增相应目的片段。20 μL的扩增反应体系包含: 5 μL 5×RT-PCR 缓冲液, 1 μL混合酶；1 μL 10 mM 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，0.1 μL酶抑制剂；上下游引物各1 μL；10.9 μL无核酸水。配制完成混匀后加入5 μL的核酸提取物。扩增产物经荧光素染色后琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察特异性片段，判断结果。

2013年4月之后的标本采用荧光定量PCR方法，流感病毒核酸提取同RT-PCR方法，提取的核酸加入扩增反应体系。20 μL的扩增反应体系包含: 19 μL核酸荧光PCR检测混合液(含1对引物、2条探针及RT-PCR混合液)和1 μL RT-PCR酶(含逆转录酶和Taq DNA聚合酶)。配好后混匀，加入5 μL 核酸提取物，按照说明书设置参数，扩增曲线与阈值焦点对应的循环数(cycle threshold, Ct)值≤38，判为阳性。

1.4 观察指标 记录分析2010年1月至2015年12月流感病毒型别分布、季节分布、暴发疫情和病毒分离，以及人群特征(性别、年龄)；同时分析哨点医院流感样病例在门诊病例的占比情况。

1.5 统计学方法 运用SPSS 21.0软件对相关数据进行分析，Excel 2007建立数据库绘制数据曲线。计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流感核酸检测结果 ILI咽拭子标本3 890份中，检测出流感病毒核酸阳性422份，总阳性率10.85%(422/3 890)。分析流感病毒亚型，A型313份(74.17%)，B型109份(25.83%)。A型中，季H3占54.27%(229/422)，新甲H1占12.56%(53/422)，季H1仅占0.47%(2/422)，A未分型占6.87%(29/422)。

2.2 流感流行年度分布 2012年以前流感病毒核酸检出阳性率均>10.00%，2012年最高，达17.74%；2013年以后均<10.00%，2013年最低，仅为7.61%。从流感病毒亚型年度分布来看，季H3和B型年度分布比较均匀。新甲H1在2012年和2015年均未被检出。季H1仅在2010年和2011年分别检出1份阳性。流感亚型的年度分布差异有统计学意义(χ2=139.866，P<0.001)。详见表1。

表1 2010～2015年六安市流感病毒核酸检测分型结果比较[例(%)]

2.3 流感病毒阳性率季节分布比较 4～7月和10～11月流感病毒阳性率低于5.00%，其他月份均>10.00%。流感病毒阳性检测时间分布呈现明显双峰，分别为7～9月和12月至次年3月。流感病毒亚型阳性月份分布存在差异，新甲H1和B型呈单峰特征，季H3呈双峰特征。由于季H3阳性率较高，导致流感病毒总体阳性率呈现双峰特征。流感病毒阳性率月份差异有统计学意义(χ2=674.522，P<0.001)。详见表2、图2。

表2 不同月份流感病毒不同型别核酸检测阳性情况比较[例(%)]

图2 六安市2010～2015年流感不同亚型月份分布

2.4 流感疫情暴发情况 2010～2015年，全市报告3起流感暴发疫情，均发生于中小学学生，时间分别为2010年1月、2011年3月、2013年12月，均在冬春季。实验室流感核酸检测结果显示，引起流感暴发流行的2例为季H3，1例为B型。

2.5 哨点医院ILI就诊分布 2010～2015年六安市人民医院第二门诊部就诊438 379人次，其中，ILI 14 127人次(3.24%)。2010～2015年流感样病例占就诊人数分别为2.21%、2.58%、2.75%、3.73%、3.37%和4.30%。流感发病有多个高峰，分别出现在2013年4～7月、2014年1月、2014年5月、2015年5～8月、2015年12月，月就诊人数均超过300人，2015年7月最高，达437人。

2.6 流感病毒核酸阳性标本年龄分布 各年龄组均有流感病毒核酸阳性病例，0～4岁年龄组和25～59岁年龄组阳性率构成比最高，均为23.70%，≥60岁年龄组阳性率构成比最低，不同年龄组阳性率差异有统计学意义(χ2= 196.275，P<0.001)。详见表3。

表3 六安市2010～2015年各年龄组流感病毒检测情况比较

注：ILI为流感病例

2.7 流感病毒核酸阳性标本性别分布 422份流感病毒核酸阳性标本，男性阳性率11.13%(235/2 111)，女性阳性率为10.57%(187/1 769)，差异无统计学意义(χ2=0.313，P=0.576)。

2.8 流感病毒分离 178例样本共分离123株流感毒株，其中，A型流感毒株95株，B型流感毒株(以B-Yamagata系为主)28株。季H3、新甲H1、B型流感病毒分离阳性率分别为74.11%、50.00%和66.67%，差异无统计学意义(χ2=5.532，P=0.063)。2012～2015年流感病毒检测阳性率总体呈增高趋势，2015年达92.16%，差异有统计学意义(χ2=40.205，P<0.001)。详见表4。

表4 流感亚型病毒分离阳性率比较

3 讨论

流感病毒的传播途径包括接触传播、飞沫传播及被污染物品的接触传播等[4]。由于流感病毒薄膜上的血凝素和神经氨酸酶都易发生抗原性漂移和抗原性转变，同时流感病毒亦可发生基因突变和重组形成新的亚型，接种流感疫苗也不能对所有的流感型别进行免疫保护，所以流感病毒容易引起大流行。

六安市2010～2015年流感监测结果表明，本地区的流感主要以A型中的季H3为主，占70.85%(229/422)；B型流感次之，占25.83%；而新甲H1的年度分布差异明显， 2012年和2015年全年均未检出新甲H1，与河北省报道流感亚型流行基本一致[5]。但桂林市报道流感病毒阳性率高于我市，而且流感主要以B型为主，发病高峰集中在3～5月，与我市差别较大[6]，可能与桂林属低纬度地区有关。而ILI核酸检测阳性率在冬季和夏季比较高，阳性率为17.74%(323/1 821)，春秋季反而较低，阳性率仅为4.78%(99/2069)，与全国其他地市不完全一致[7-10],呈明显的双峰，所以每年要做好7月和12月流感高发季节来临之前的防控工作。

从流感亚型核酸阳性分布来看，季H3在冬季和夏季核酸阳性率较高，达10.65%(195/1 821)，而春季和秋季流感核酸阳性率仅为1.69%(35/2 069)，也影响了流感病毒核酸总阳性率，而新甲H1和B型的阳性率冬春季较高，阳性率达7.52%(149/1 981)，与全国一些地市报道一致[7,11]。

流感监测是预防和控制流感流行的关键措施之一，我国所有的地级市均建立了流感网络实验室[12]。从六安市的流感监测数据来看，5岁以下儿童和25～59岁年龄组流感核酸阳性病例比重较高，但从流感样病例核酸检测阳性率来看，15～24岁年龄组阳性率最高，为8.25%(87/1 054)，而丹东地区报道5～14岁年龄组阳性率最高，可能由于其他年龄组标本过少[14]。30岁以上，感染流感新甲H1亚型后，易引起较为严重的呼吸困难症状[14]。分析发现六安市男女流感核酸检测阳性率差异无统计学意义，与鹰潭市报道一致[7]。

从近六年流感哨点医院ILI就诊人数得出就诊人数升高滞后于流感检测阳性率升高。提示流感监测可以为全市的流行高峰起到预警和指导作用[10]。由此可见，ILI就诊人数的增减与流感病毒核酸检测阳性率并不一致，主要源于患者就诊的滞后[15]。

六安市流感网络实验室于2009年8月开展工作，用普通RT-PCR进行流感病毒核酸检测，155份咽拭子标本流感病毒核酸阳性其中29份为A未分型，占18.71%(29/155)，低于鹰潭市的报道[7]。这主要是由于普通PCR检测技术的灵敏度和特异性都不高、影响因素多引起的。自2013年购置荧光定量PCR以后，所有的流感阳性标本均能够分型，可见荧光定量PCR法在核酸检测方面准确度高，同时检测过程也更方便，是流感网络实验室不可缺少的检测设备。

流感实验室检测，是为流感监测提供可靠的病原学数据，是分析流感流行病学特征的重要依据，是有效控制流感流行的必要措施。流感实验室检测设备和人员技术力量是流感检测能力的必要保证，六安市的流感病毒分离阳性率较高，达69.10%(83/112)，高于其他省市[11,16-17]。

六安市处于亚热带湿润季风气候，一年四季分明，季节变化明显，是流感易于流行的地区。本研究通过对2010～2015年流感病原学检测及国家流感监测网络数据，综合分析六安市流感流行病学特征流行病特征，对了解本地流感的流行规律及防控对策提供了一定的理论依据。不断加强流感重点人群及病原学的监测，提前发现潜在的流感病毒暴发或流行，可为制定流感防控策略和措施提供有力依据。

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