肺鳞癌组织中IGF1和CCL20的表达与患者临床病理特征及预后的关系

孙 宇 雍 翔 孙 祝 尹 群 赵玉魁

肺癌是发病率和死亡率较高的呼吸系统恶性肿瘤之一。外科手术一直是早期肺癌患者的首选治疗方案，但是由于肺癌起病隐匿，恶化程度较高，很多患者确诊时已至中晚期，错过了手术的最佳时机[1-2]。因此，寻找特异性的作用靶点、早诊断、早干预是肿瘤治疗领域相关专家和学者一直积极探索的课题。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)属于酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，因其具有促进细胞增殖、分化及血管形成的作用在肿瘤发生发展过程当中的影响日益受到人们的关注[3-4]。趋化因子20(chemokine ligand 20，CCL20)是趋化因子CC家族重要成员之一，CCL20在肝脏、肺脏、扁桃体等器官中呈高表达，尤其是与肝癌细胞的侵袭和转移密切相关[5]。但目前鲜有研究明确IGF-1和CCL20与肺鳞癌发生、发展的关系。本研究通过免疫组化方法检测IG-1和CCL20在肺鳞癌组织中的表达水平，并探讨其与患者临床病例特征及预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年2月至2015年2月皖北煤电集团总医院收治的30例肺鳞癌患者术后新鲜组织标本，检测2GF-1及CCL20。其中，男性19例，女性11例；年龄31～69岁，平均(52.47±9.56)岁；16例患者术前出现淋巴结转移；按国际抗癌联盟(2016年)TNM肿瘤分期标准分期[6]，I～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ1期17例。纳入标准：①所有患者均符合美国国家综合癌症网络关于肺癌的诊断标准[7]，未合并其他恶性肿瘤者；②所有患者术前未接受放疗、化疗或其他辅助治疗。排除标准：①合并严重肝肾功能障碍者；②合并其他恶性肿瘤者；③妊娠哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测方法 按照SP免疫组化检测试剂盒(北京中衫桥公司生产)说明书标明的实验步骤检测所有病理切片中IGF-1和CCL20蛋白的表达：①将石蜡包埋组织切片，脱蜡水化后，切片，置于载玻片上，烘干48 h后待用；②抗原热修复；③灭活内源性过氧化物酶；④封闭；⑤加入抗人IGF-1抗体或CCL20抗体(美国Abcam公司，1:250稀释)孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)试剂显色；⑦苏木精复染；⑧将染色后的病理切片置于显微镜下观察，随机选择10个视野，观察细胞阳性表达情况。

1.2.2 结果判定 病理结果由病理科医师独立判断,将病理片置于光学倒置显微镜(日本OLYMPUS)下，选择10个不同的视野,其中每个视野选取100个细胞，分析细胞染色强度以及占据的比例，积分=细胞染色强度×细胞比例，根据积分判断免疫组化结果：①0分(阳性率为0)；②1分(阳性率<25%)；③2分(阳性率25%～50%)；④3分(阳性率50%～75%)；⑤4分(阳性率>75%)。同时观察细胞染色强度：①0分(阴性)；②1分(弱染色)；③2分(中度染色)；④3分(强染色)。染色指数(labeling index，LI)=阳性细胞率×染色强度，根据总分数将切片分为1～4级：①1级(0～1分)为阴性；②2级(2～3分)为弱阳性；③3级(4～8分)为中度阳性；④4级(9～12分)为强阳性。2级以上即为阳性表达[5]。详见图1。

1.2.3 随访 治疗结束后头3个月，每个月复查1次；3～12个月，每3个月复查1次；1年后，每6个月复查1次。复查项目包括体检、血常规、肝功能、胸部CT等。统计所有患者3年生存率。生存率=生存患者数/总患者数×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计数资料用率表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法；采用log-rank检验进行单因素分析，采用kaplan-meier计算中位生存时间，采用Cox比例风险模型分析IGF-1、CCL20表达与预后的关系，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-1、CCL20表达与患者病理特征的关系 免疫组化结果显示，18例(60.0%)患者IGF-1蛋白呈阳性表达，23例(76.67%)患者CCL20呈阳性表达。单因素分析显示，IGF-1表达与患者TNM分期以及淋巴结转移有关(P<0.05)；CCL20表达与患者淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关(P<0.05)。详见表1。

表1 IGF1、CCL20表达与患者一般临床资料及病理特征的关系

表1续

因素例数IGF-1蛋白[例(%)]CCL20蛋白[例(%)]阳性P值*阳性P值*分化程度1.0000.418 高-中分化21(50.00) 低-未分化2817(60.71)1(50.00)22(78.57)浸润深度0.2640.017 T1、T2136(46.15) T3、T41712(70.59)6(40.00)17(80.95)淋巴结转移0.0240.031 有1613(81.25) 无145(35.71)15(93.75)8(57.14)肿瘤直径0.7100.390 <4 cm158(53.33) ≥4 cm1510(66.67)10(66.67)13(86.67)TNM分期0.0080.025 I～Ⅱ期134(30.77) Ⅲ～Ⅳ期1714(82.35)7(53.85)16(94.12)

注：*表示采用Fisher确切概率法

2.2 IGF-1及CCL20与肺鳞癌患者预后的关系 所有患者平均随访时间为(21.38±7.46)个月。患者3年总生存率为63.33%(19/30)。IGF-1阳性组患者中位生存时间为17个月，IGF-1阴性组患者中位生存时间为23个月；CCL20阳性组患者中位生存时间为16个月，CCL20阴性组患者中位生存时间为23个月。经Kaplan-Meier法进行生存分析Log-rank检验单因素分析，结果显示，浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、IGF-1表达、CCL20表达对生存期有明显影响(P<0.05)。采用多因素Cox比例风险模型分析影响肺鳞癌患者预后的危险因素，结果显示，浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、IGF-1、CCL20阳性表达与肺鳞癌患者预后密切相关，是影响肺鳞癌患者生存期的独立危险因素(P<0.05)。详见表2。

表2 Cox比例风险模型分析影响肺鳞癌患者预后的危险因素

3 讨论

肺癌是临床上常见的呼吸系统恶性肿瘤之一，发病率和死亡率位于各种癌症疾病之首。尤其是肺鳞癌，虽然在我国发病率低于肺腺癌，但是由于目前尚缺乏特异性靶向治疗药物，肺鳞癌患者预后较差，很多患者即使采取了肺切除术，仍然存在较高的复发率和转移率，因此探讨肺鳞癌的发病机制以及寻找针对肺鳞癌治疗有效的潜在靶基因具有十分重要的临床价值。

胰岛素样生长因子是与胰岛素高度同源的蛋白分子，可与IGF1以及IGF两种配体结合，通过激活磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase，PI3K)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路等，参与调控肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭、凋亡等恶性生物学行为[7]。有研究[8]显示，IGF1高表达与肝癌的发生发展密切相关。最新研究[9]表明，非小细胞癌患者的标本当中超过30%存在着IGF1基因的阳性,同时超过10%的患者存在着基因扩增问题，同时基因拷贝数在非鳞癌患者以及鳞癌患者之间存在显著差异，并且IGF1阳性表达同淋巴结转移之间存在显著正相关，同时肺鳞癌组织当中的IGF1表达显著高于癌旁健康组织。在本项研究中，笔者经免疫组化检测发现IGF1在肺鳞癌组织中阳性表达率高达60%，因此推测IGF-1高表达可能与肺鳞癌的发生、发展存在一定的联系。通过进一步分析IGF-1与肺鳞癌患者病理特征以及预后的相关性，结果显示，IGF1的表达率随着患者病理学分级的下降而上调，且IGF1高表达患者的3年生存率明显低于IGF-1阴性表达患者,提示IGF1高表达是影响肺鳞癌患者预后的重要风险因素。同时IGF1的高表达同患者的肿瘤复发以及淋巴结转移等因素存在联系。本研究结果与国内外大多数研究结论基本一致[10-12]。

趋化因子与炎性反应、免疫细胞归巢等生物学过程密切相关[13-14]。近几年，随着分子生物学的深入发展，有学者认为由恶性肿瘤分泌的趋化因子通过与不同受体结合后刺激血管生成、炎性细胞的浸润以及蛋白降解等，在肿瘤的侵袭、转移过程中发挥着重要作用[15]。既往有研究[16]发现，肺癌组织当中CCR6以及CCL20的表达显著高于正常的肺组织，且同患者的分期存在正相关，高表达的CCR6肺癌患者标本细胞添加CCL20共同培育，细胞伪足显著增加，提示CCL20有着强化肺癌细胞转移能力以及侵袭能力的效果。本组资料显示，CCL20表达同肺鳞癌患者的淋巴结转移、肿瘤浸润深度、TNM分期等存在显著正相关(P<0.05)，在Ⅲ、Ⅳ期肺鳞癌患者组织当中的CCL20阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者。这表明肺鳞癌患者随着肿瘤浸润深度的加深以及淋巴结转移的出现，患者肿瘤组织内CCL20阳性表达率逐渐上调。因此可以推测CCL20可能与肺鳞癌发展以及侵袭密切相关。目前已有研究表明检测趋化因子CCL20表达可作为判断肺鳞癌患者复发或转移的可靠指标[17]。但是关于CCL20具体作用于肺鳞癌的机制尚需进一步研究证实。

综上所述，IGF1以及CCL20在肺鳞癌患者组织当中的表达对肺鳞癌病情的发生以及转移有重要影响，在筛查肺鳞癌患者病情以及评估患者预后质量方面有重要的参考价值,能够为患者的靶向治疗提供思路。

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