面向现场快速检测的高分辨Blu-ray成像技术研究

徐鹏涛,任双宝,张校亮

(1.中国船舶重工集团公司第七二三研究所,江苏 扬州 225101;2.太原理工大学,山西 太原 030024)

0 引 言

传统的生化检测方法有酶联免疫吸附法、分光光度法、色谱法和光谱法等，这些成熟的检测方法存在检测时间较长、检测成本昂贵和仪器操作复杂等缺点。因此，许多研究致力于开发面向普通大众的低成本现场快速检测(POCT)设备。其中，利用大众身边常用的一些电子设备如手机、扫描仪和数码相机等，通过对其简单的改装或者以编写软件的方式实现自定义的控制，进而使其作为生物分子传感器的快速读出设备有效地实现分子诊断或有害物质的检测，是近年来的研究热点[1-2]。随着光盘技术的不断发展，许多学者以标准光盘/光驱技术为基础，研究了以光盘为反应基底、光驱为检测器的生物化学检测方法，将标准的或改装后的光盘/光驱作为一种新型的POCT工具，广泛运用到诸多检测领域。这种检测方法主要分为标准光驱检测法和光驱改造检测法。Lange等[3]将光驱激光头置于暗场光学显微镜的顶部,使其改装成为“光驱成像仪”，实现了检测限达到单个分子水平的纳米金颗粒标记银染色后的免疫反应的检测；Potyrailo等[4]从光驱电路板上提取光学头光电探测器模拟信号，然后使用数据采集卡采集和LabVIEW编写程序对光驱控制和成像从而实现了CD光盘表面的金属离子的定量检测；Harisha等[5]开发了一套具有温度闭环控制、转速控制的HIV疾病诊断设备并且特殊制作了半透射半反射的微流控生物光盘，再将标准DVD光驱置于这套设备中，增加光电探测器使其成为了激光扫描仪并用于血液细胞中CD4+离子的鉴别与计数，最小成像精度接近1 μm。上述几种方法由于对标准光驱采取了过度改造，导致普通用户无法使用光驱的原有功能，破坏了光驱的原始使用性。加拿大于化忠教授的课题组提出并开发了一种全新的基于标准光盘/光驱的数字化生物分子检测技术[6-8]，该检测方法充分利用了光盘技术的数据保护机制，使用标准光驱结合光盘质量诊断软件的方式实现定量检测。

蓝光光盘(BD)是CD、DVD之后发展起来的一种具有高存储容量的光盘格式。区别于CD和DVD的780 nm、650 nm读取波长，蓝光光盘的命名是由于它采用了更短的405 nm蓝色激光和更高的数值孔径来进行光盘的读取与刻录。蓝光光盘更小的聚焦光斑对基于光驱的检测技术而言，意味着更高的检测通量和灵敏度[9]，基于此，本文研究了基于BD技术的高分辨成像检测方法，通过水解反应成功地将惰性的BD表面转化为有活性的生物基底，并使用C++、LabVIEW和MATLAB混合编程开发了一套完整的光驱成像检测系统。并通过实验验证了该系统的可行性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：BD-ROM(25 GB BD-R，日本威宝公司)，蓝光刻录机(日本Plextor公司)，台式计算机(Vostro 230s，美国戴尔公司)，数据采集卡(PCI8514，阿尔泰)。

试剂：磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、BSA(牛血清白蛋白)购买于 Aladdin(中国，上海)。AFB1-BSA(牛血清白蛋白包被黄曲霉素B1(Aflatoxin B1))、AFB1 抗体、AFB1 的标准试剂、柠檬酸、Tween 20(吐温-20)、Gelatin(明胶)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)购于 Sigma(美国，圣路易斯)。甲醇(CH3OH)、对苯二酚、硝酸银(AgNO3)购于科密欧(中国，天津)。叠氮化钠(NaN3)购于索莱宝科技有限公司(中国，北京)。生物素标记试剂盒-氨基购于同仁化学研究所(日本)。纳米金标记的链霉亲和素(直径为 1.4 nm)购于 Nanoprobes 公司(美国，纽约)。实验用水为超纯水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1 墨点阵列的制备与读取

(1) 选择表面干净、无划痕的空白BD-R光盘(威宝公司，Verbatim)并使用紫外臭氧清洗机(NANOSCAN)对BD-R光盘表面进行5～10 min活化处理。

(2) 根据需要使用光盘设计软件EPSON Print CD进行图案设计(在本实验中，共设计了3种不同的打印图案，分别是不同直径点阵列、不同颜色的打印条带阵列和不同灰度的打印条带阵列)，并将打印参数中的“打印颜色校正”设置为“较亮(+3)”，以使出墨量最小，之后将打印机前置可拆卸托盘按钮按下，然后将光盘数据面朝上放入打印托盘，开始打印。

(3) 光盘打印完成后，将光盘取出置于干燥箱内，在室温下干燥20 min左右后，取出静置一天以将表面墨汁干涸，防止在读取过程中，光盘转速太快而出现甩墨的情况。

1.2.2 AFB1免疫优化反应阵列的制备与读取

(1) 选择表面干净的空白BD-R光盘，将光盘浸泡在浓度为0.1 M的NaOH溶液中1.5 h，温度控制在55 ℃±1 ℃范围内，随后将光盘取出，用超纯水清洗干净光盘表面，用氮气将光盘吹干。

(2) 将浓度为100 mM的EDC和45 mM的NHS(缓冲液是pH为6的PBS溶液,0.1 M的PBS缓冲溶液由87.7 mL的0.2 M NaH2PO4溶液和12.3 mL的Na2HPO4溶液混合并加超纯水稀释至200 mL配制)的活化液滴加于光盘表面的标记区域，活化4 h。

(3) 首先将 PDMS 微通道紧贴在光盘表面标记区域，然后在各通道的加样孔注入浓度为100 μg/ml的AFB1-BSA 溶液并在对应的出样孔使用真空泵抽吸使溶液充满通道，之后静置一夜(室温下)，使 AFB1-BSA 充分固定在光盘表面，使用pH 7.4的缓冲液冲洗通道，注入缓冲液1(pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,and 0.05% NaN3)，封闭 3 h，然后注入buffer 2 (pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,0.05% NaN3)，封闭1 h，之后再用 10 mM PBS 缓冲液冲洗微通道。

(4) 将2 μL生物素标记的AFB1 抗体(浓度1～25 μg/ml)注入通道内反应1 h。

(5) 注入浓度为 1.6 μg/mL 的 Nanogold-Streptavidin 溶液(20 mM pH为7.4的PBS缓冲液，150 mM NaCl,0.1% BSA,and 0.05% NaN3)，室温下反应 1 h。

(6) 揭下 PDMS 微通道后，先使用超纯水将BD光盘表面冲洗干净，再用氮气吹干。

(7) 将新配制的浓度为48 mM的silver nitrate和 浓度为182 mM的hydroquinone按照 1∶1 比例均匀混合后铺设到标记的反应区域，银染6 min左右，整个银染过程需保证在避光环境中操作。

(8) 用超纯水冲洗光盘表面，并用氮气吹干，最后将光盘放入光驱中，使用本文开发的光驱成像检测系统完成生物光盘的读取采集和成像分析。

2 结果与讨论

2.1 光驱成像检测系统的设计

基于标准蓝光光盘/光驱的成像检测系统由标准蓝光光驱、数据采集卡、个人计算机和应用软件四部分构成。采集信号由光驱中电路板接出，经BNC接口由数据采集卡采集。由于数据采集卡与主机之间PCI接口的需要，本系统使用了Dell 的Vostro 230s台式计算机作为采集数据的接收、存储与处理分析的平台。应用软件开发在Windows环境下完成，使用LabVIEW开发了系统UI和部分功能，C++编写了光驱控制的动态链接库，MATLAB完成了数据图像处理的一些功能。通过动态链接库和ActiveX技术将所有功能整合至同一LabVIEW工程，开发了一套完整的应用软件。软件整体工作流程图和操作界面如图1所示。

图1 光驱成像系统工作流程图和操作界面

2.2 光驱成像检测的原理和系统可行性分析

本文所提出的基于标准蓝光光盘/光驱成像检测技术是根据BD光驱读取光盘时激光头的光学精确扫描原理，即BD光盘表面发生生物识别反应的位点(经金/银纳米粒子信号扩增后)会干扰读取激光束对刻录在光盘上的信息的正常读取，光驱激光头中光电二极管接收到的光束强度就会随之降低，相应的幅值变化可以用于量化分析。同时，在读取过程中激光头呈螺旋线精确扫描光盘表面，相邻螺旋线轨道间距可达0.32 μm。而利用该原理实现分子定量检测的关键问题是建立扫描光盘的光学信号数据提取、处理与成像分析，得到待检物浓度变化的关系。为此，在BD光盘表面打印了6条灰度不同的线段组成的阵列，如图2所示。之后使用基于标准蓝光光盘/光驱成像检测系统对光盘进行测试。检测结果表明，在光盘读取至相应位置时，BD表面的阵列产生了6个幅度变化依次升高的峰，而这6个峰的峰值与打印线段一一对应，实验结果证明了该方案的可行性。

图2 BD表面打印线段阵列模拟检测

2.3 基于标准蓝光光盘/光驱成像检测技术的检测灵敏度与分辨率

实验中使用的BD光盘表面颜色呈深色，打印的阵列图案在灯光反射下方能看得清。因此，拍照对其上打印的检测阵列的灰度分析变得不太容易实现。而由光驱成像检测系统原理可知，这种精密聚焦扫描的成像方式可以解决这一问题。

为了验证基于标准蓝光光盘/光驱成像检测技术的检测灵敏度与分辨率，在BD表面打印12个不同尺寸的墨点阵列进行模拟实验验证。如图3(a)所示，每个墨点阵列均为打印的2个直径从100 μm 到600 μm的6×12个点的阵列，图3(b)为打印BD光盘的光学图片及使用基于标准蓝光光盘/光驱成像检测系统进行成像检测的结果。从图中可以看出，打印的点全部可以检测到，因此使用基于标准蓝光光盘/光驱成像检测技术可以实现很高的灵敏度和检测通量。

图3 高检测通量测试

2.4 BD表面AFB1优化反应的定量检测

BD表面AFB1优化反应的定量检测实验反应后的BD光盘如图4所示。

图4 AFB1免疫优化反应阵列BD光盘

图4 (a)中，标准样品阵列共6个条带，浓度分别为：1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、14 μg/mL、18 μg/mL。使用本文开发的光驱成像检测系统成像结果如图4(b)所示，光盘上的标准线和样品阵列可以完整地检测出来，且在伪色图Color bar为hot的图像中，可以直观地看到标准线中6个条带的亮度值有逐渐升高的趋势。对生成的图像分别使用“检测分析”和“附加模块”进行分析，结果如图5所示。

图5(a)为使用“附加模块”对所成图像的8位灰度图进行线像素值测试，直观地从数值上分析，6个反应条带的像素峰值分别约为92、110、127、162、195、223。为了进一步更精确地检测，使用“图像分析”对所成图像的16位tif格式图进行全图像分析，结果如图5(b)所示。相较于图5(a)中线像素值测试，图5(b)则对反应条带内的所有像素值取均值，避免了可能存在的条带灰度不均匀，使检测结果更加准确。图5(c)为(b)中标准线区域的放大图，可以看到6个反应条带的像素均值分别为21 937.18、25 487.98、30 530.92、34 678.58、39 015.89、44 166.13。

为了通过标准线得出检测待测样品的浓度，首先由图5(b)得出3个待测样品条带的像素均值分别为39 563.79、31 793.08、28 304.67，然后将标准线中每个条带对应的生物素标记的AFB1 抗体浓度和像素均值分别输入标准样品浓度和标准像素值中，将待测样品条带的像素均值输入标准像素值中，通过曲线拟合计算得出标准品曲线方程，继而求出3个待测样品的浓度分别为：13.081 μg/mL、5.836 μg/mL、3.496 μg/mL，如图6所示。

图5 AFB1免疫优化反应阵列BD光盘所成图像的检测分析

图6 AFB1免疫优化反应阵列BD光盘检测结果

3 结束语

本文提出了基于蓝光技术的数字化分子检测方案，使用C++、LabVIEW和MATLAB混合编程技术，对基于标准蓝光光盘/光驱的成像检测系统进行了研究、设计与实现，使标准蓝光光驱经过简单的光学信号提取就可以成为专业化的POCT诊断设备。通过对光盘表面微尺度墨点阵列的分析，表明了蓝光检测系统的横向分辨率小于蓝光光盘表面的光斑直径(138 μm)，可以检测出直径小于100 μm的墨点；通过对AFB1优化反应的分析，得出其可以作为生物反应灰度学分析测试的平台，应用于医疗诊断、环境监测以及食品安全等领域。

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