高效液相色谱法同时测定黄芪护肝胶囊中7种活性成分的含量

2018-06-17纪国力刘斌

中国当代医药 2018年11期

纪国力刘斌

[摘要]目的建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定黄芪护肝胶囊中延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、五味子醇甲、大黄酚等主要成分含量的方法。方法采用HPLC检测黄芪护肝胶囊中延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、五味子醇甲、大黄酚等主要成分，色谱柱为CNW Athena C18型，流动相为甲醇（A）和0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；检测波长中，延胡索乙素为210 nm，芍药苷、橙皮苷和五味子醇甲为230 nm，丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚为265 nm。考察检测黄芪护肝胶囊中各检测成分的线性范围、回收率和可重复性。结果延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚的线性范围分别为1.26～25.20 μg/ml（r=0.9996）、7.03～140.60 μg/ml（r=0.9998）、3.63～72.60 μg/ml（r=0.9997）、2.11～42.20 μg/ml（r=0.9994）、1.98～39.60 μg/ml（r=0.9995）、3.10～62.00 μg/ml（r=0.9996）和2.28～45.60 μg/ml（r=0.9995），7种成分的平均加樣回收率（n=6）分别为99.6%、98.9%、98.7%、99.2%、98.2%、98.8%、98.2%，RSD分别为1.7%、1.0%、1.2%、1.5%、1.2%、1.2%、1.0%。结论本方法结果准确，重现性好，回收率高，可用于黄芪护肝胶囊的质量控制。

[关键词]高效液相色谱法；黄芪护肝胶囊；延胡索乙素；芍药苷；橙皮苷；五味子醇甲；丹参酮ⅡA；大黄素

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（b）-0016-05

Simultaneous determination of 7 active components in Huangqi Hugan Capsules by high performance liquid chromatography

JI Guo-li LIU Bin▲

Tai′an Food and Drug Inspection and Testing Center，Shandong Province，Tai′an 271000，China

[Abstract]Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of main components of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Tanshinone ⅡA，Hesperidin，Emodin，Schisandrin A and Chrysophanol in Huangqi Hugan Capsules.Methods HPLC was used to detect the aforementioned components in Huangqi Hugan Capsules.The column was CNW Athena C18 and the mobile phase was methanol （A） and 0.1% aqueous solution of phosphoric acid （B） in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min at 30℃ column temperature.The detection wavelength were 210 nm for Tetrahydropalmatine，230 nm for Paeoniflorin，Hesperidin and Schisandrin A，and 265 nm for Tanshinone ⅡA，Emodin，and Chrysophanol were 265 nm.The linear range，recovery，and repeatability of each component in Huangqi Hugan Capsules were examined.Results The linear ranges of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Hesperidin，Schisandrin A，Tanshinone ⅡA，Emodin and Chrysophanol were 1.26-25.20 μg/ml （r=0.9996），7.03-140.60 μg/ml （r=0.9998），3.63-72.60 μg/ml （r=0.9997），2.11-42.20 μg/ml （r=0.9994），1.98-39.60 μg/ml （r=0.9995），3.10-62.00 μg/ml （r=0.9996），and 2.28-45.60 μg/ml （r=0.9995）.The average recovery of 7 components （n=6） was 99.6%，98.9%，98.7%，99.2%，98.2%，98.8%，and 98.2%，respectively.RSD was 1.7%，1.0%，1.2%，1.5%，1.2%，1.2% and 1.0%，respectively.Conclusion The method is accurate and reproducible in a high recovery，which can be used for quality control of Huangqi Hugan Capsules.

[Key words]High performance liquid chromatography；Huangqi Hugan Capsules；Tetrahydropalmatine；Paeoniflorin；Hesperidin；Schisandrin A；Tanshinone Ⅱ A；Emodin

黄芪护肝胶囊是临床常用的保肝药物，是由多种中药组成的复方制剂，其中包括赤芍、丹参、延胡索、大黄、陈皮等主要有效成分，用于慢性肝炎以及药物性肝损伤等疾病的治疗，其药理作用复杂，如延胡索具有行气、止痛、活血作用，其有效成分延胡索乙素具有镇痛、催眠、降低冠脉阻力及增加血疫调节等作用[3]；五味子具有补肾宁心、抗衰老等作用[4]；丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈止痛的作用；丹参酮ⅡA具有保护心血管、抗肿瘤、抗氧化等作用[5]；大黄具有利湿泻下、清热泻火等作用[6]，黄芪护肝胶囊的药理药效与其中中药组分的活性成分密切相关。本研究就黄芪护肝胶囊中延胡索、赤芍、五味子、陈皮以及丹参和大黄中的有效药理成分含量的测定方法进行研究。

1仪器与试药

1.1主要仪器

二极管阵列检测器（SPD-M20A型，日本島津公司），高效液相色谱仪（LC-20AD型，日本岛津公司），LC solution色谱工作站（日本岛津公司），电子天平（十万分之一级，瑞士梅特勒公司）。

1.2试药

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201337），延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110726-201414），橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110721-201115），五味子醇甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110857-201211），自制黄芪护肝胶囊（批号为20141010、20140912、20141020）。大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110），丹参酮ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110766-200619），大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110796-200716），其他试剂为分析纯和纯化水。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）采用梯度洗脱（0～10 min，A 33%；10～20 min，A 33%～65%；20～30 min，A 65%；30～35 min，A 65%～78%；35～50 min，A 78%；50～55 min，A 78%～85%；55～60 min，A 85%；60～70 min，A 85%～33%）；大黄素、丹参酮ⅡA、大黄酚检测波长为265 nm；延胡索乙素检测波长为210 nm，芍药苷、五味子醇甲和橙皮苷检测波长为230 nm，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃。延胡索乙素、大黄酚、芍药苷、大黄素、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA理论塔板数均≥5000，分离度均>1.5。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品储备液和对照品溶液精密称取适量7种对照品，分别采用甲醇溶液制成质量浓度为126、703、363、211、198、310、228 μg/ml的对照品储备液备用。然后精密适量量取各种储备液，加甲醇制成含延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素、大黄酚分别为12.6、70.3、72.6、42.2、19.8、31.0、22.8 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液黄芪护肝胶囊研磨成均匀细末，采用电子天平称取粉末1 g，锥形瓶内加入25 ml甲醇溶液及1 g黄芪护肝胶囊粉末，称重后在功率频率50 KHz、300 W条件下进行超声震荡处理30 min，冷却后采用甲醛溶液补重，应用0.45 μm微孔滤膜进行过滤。

2.2.3阴性对照溶液按照“2.2.1”中对照品溶液制备过程，分别制备不含有陈皮、延胡索、丹参、赤芍、延胡索和大黄单品的阴性对照溶液。

2.3空白试验

适量供试品、对照品及阴性对照溶液注入LC-20AD型高效液相色谱仪，参数设置如下。进样量：10 μl；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃。记录色谱图，分析检测效果。结果显示，供试品中延胡索乙素、五味子醇甲、橙皮苷、大黄素、大黄酚、芍药苷、丹参酮ⅡA色谱峰保留时间与对照品一致，阴性对照溶液在相应对照品溶液相同保留时间处无干扰峰出现，提示黄芪护肝胶囊中延胡索、赤芍、五味子、陈皮以及丹参和大黄以外的其他中药组分对测定结果无干扰。HPLC图谱见图1～8。

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图1 对照品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图2 样品HPLC色谱图

2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图3 缺延胡索阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图4 缺赤芍阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图5 缺陈皮阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图6 缺五味子阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；6.大黄素；7.大黄酚

图7 缺丹参阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA

图8 缺大黄阴性对照样品HPLC色谱图

2.4线性关系考察

分别精密吸取延胡索乙素、芍药苷、大黄素、大黄酚橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA，对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，加甲醇溶液稀释至10 ml，配置成梯度浓度的混合对照品溶液，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃条件下分别进样检测，记录色谱图。以浓度C（μg/ml）对峰面积A进行线性回归，延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚的回归方程分别为：A=4.295×104C+1.374×103（r=0.9996）、A=3.547×104C+3.584×103（r=0.9998）、A=2.236×104C+3.750×103（r=0.9997）、A=6.140×104C+3.366×103（r=0.9994）、A=4.119×104C+2.794×103（r=0.9995）、A=2.155×104C+3.462×103（r=0.9996）和A=3.447×104C+1.863×103（r=0.9995）。橙皮苷、延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、大黄酚、大黄素的线性范围分别为3.63～72.60、1.26～25.20、7.03～140.60、1.98～39.60、2.11～42.20、2.28～45.60、3.10～62.00 μg/ml。

2.5精密度试验

取混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃，连续进样6次，考察精密度。延胡索乙素、五味子醇甲、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.5%、0.6%、0.4%、0.7%、0.6%、0.5%和0.8%。

2.6重复性实验

按“2.2.2”项下，平行制备同一样品（批号：20140912）6份，依法进行测定，并分别计算含量，延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚的RSD分别为1.0%、0.6%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%和1.1%。

2.7稳定性试验

取供试品溶液分别在0、2、4、6、8、10、12 h依次进行测定，延胡索乙素、芍药苷、五味子醇甲、橙皮苷、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.8%、0.6%、0.8%、0.7%、1.0%、1.0%和1.2%。

2.8回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：20140912）0.5g，共6份，分别精密加入延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚峰对照品贮备液1.0 ml，按照“2.2.2”步骤制成供试液，依次进行加样测定，计算各样品回收率，结果见表1。

2.9样品测定

取3批黄芪护肝胶囊样品，按“2.2.2”步骤配制供试品溶液，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃进样检测，记录色谱图，用外标法分别计算样品中延胡索乙素、五味子醇甲、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、大黄酚含量（表2）。

3讨论

3.1检测波长的选择

黄芪护肝胶囊是中药复方制剂，其中主要的重要組分有18种，赤芍、丹参、延胡索、大黄、陈皮等是主要的药效成分，其中活性成分的含量对药理药效的发挥具有重要作用，而对于其中主要药理成分的检测是进行质控的方法之一，其中延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、五味子醇甲、大黄酚等是具有活性的主要药理成分。为了能够同时对其采用高效液相色谱法进行检测，选择能够适合多种组分的检测波长具有重要作用，如橙皮苷在207 nm和283 nm具有特征性的吸收峰，而在波长230 nm时候延胡索乙素的吸收峰最强，在217 nm波长条件下五味子醇甲的吸收峰最大，而在230 nm波长时五味子醇甲的吸收峰也较强，而且分离度好，灵敏度高，能够取得较好的检测效果，因此以上几种成分检测过程中采用230 nm作为共同的检测波长能够取得较为理想的效果。丹参酮ⅡA在224 nm和268 nm波长处有特征吸收，大黄素在222 nm波长处有最大吸收，且在252、265、289 nm波长处有特征吸收，225 nm和256 nm波长处大黄酚均具有特征性的吸收峰，但265 nm波长处大黄酚也有较强吸收，而且检测效果稳定，灵敏度高，分离度好，无基线飘移，能够取得较好的检测效果，因此对于丹参酮ⅡA、大黄酚和大黄素的共同检测波长确定为265 nm。

3.2流动相的选择

既往的文献研究显示[7-15]，甲醇-磷酸盐溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及甲醇-0.1%磷酸溶液在检测过程中均可作为流动相。研究结果显示，以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相能够取得较好的分离效果，检测物的吸收峰对称且较为尖锐，吸收峰的形态较为理想，理论搭板数更高。黄芪护肝胶囊中的成分较为复杂，检测物质的性状存在较大的差别[16-20]，为了获取较好的检测效果，使各检测物的色谱峰分离度更好，出峰时间更合理，通过梯度洗脱的方法，对甲醇和0.1%磷酸溶液配比的不断调整，对载液的极性、离子强度等不断优化，使得检测物质均能获得良好的吸收峰，而且无杂质峰形成及干扰，获得较好的效果。

3.3供试品溶液制备方法的选择

为了考察不同溶剂以及不同方法提取效果，分别采用超声提取和回流提取，并且在提取过程中采用70%甲醇溶液、乙醇溶液和甲醇溶液作为溶剂进行考察，结果显示延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚等7种检测物在甲醇溶液中较为稳定，杂质干扰小，提取效果较好，对不同的提取技术进行比较发现，超声提取的效果比回流提取的效果要好，采用甲醇为溶液、采用超声提取30 min能够获得最好的提取效果。综合评定，采用本研究中的方法测定黄芪护肝胶囊中的7种有效成分重复性好，回收率高，结果准确，而且操作简便，适宜于在黄芪护肝胶囊的质量控制中使用。

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