小核糖核酸病毒科病毒细胞受体研究进展

王兴陇，冯若飞

(1.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

小核糖核酸病毒家族是一个古老多变的家族，也是人畜较为重要的病原体，该病毒可能导致人和动物的亚临床感染，从轻度发热疾病到心脏、肝脏和中枢神经系统的严重疾病.近年来，该科病毒的感染机制、受体等逐渐成为学术界研究的热点.随着研究的不断深入，其家族数目持续上涨，2012年曾被分为17个属[1]，目前已经增加为40个属.

1 小核糖核酸病毒

1.1 定义

由病毒学组设立的国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)可知小核糖核酸病毒科病毒包含60个原体，病毒颗粒的直径在30～32nm之间，形状为二十面体，沉降系数为140～165，表面光滑，没有包膜覆盖[2，3，4]，其RNA多为6.7-10.1kb的带poly-A尾的正义非分节RNA，RNA合成发生在重组的细胞质复制细胞器中，该细胞器含有来源于编码多蛋白的2BC-P3区域的非结构蛋白，基因组5'和3'末端的RNA结构直接启动RNA合成，并且尿苷化的3B用作合成两条RNA链的引物。这些小核糖核酸病毒颗粒的单链RNA含有可分为三个区域的开放式阅读框架，这三个区域分别为P1区、P2区和P3区.P1区编码衣壳蛋白，P2区和P3区编码的蛋白参与病毒的各项生命活动[3，4，5].

小核糖核酸病毒七类中至少有五类的宿主是脊椎动物，小核糖核酸的天然宿主多为一种物种或者极少数的几种物种，但是口蹄疫病毒(FMDV)和脑心肌炎病毒(EMCV)例外.大多数物种的成员可以在细胞培养中生长.通过用裸露的感染性RNA转染，抗性宿主细胞(例如在灵长类动物特异性脊髓灰质炎病毒情况下的小鼠细胞)通常可以被感染。传播是水平的，主要通过粪便，口腔或空气路线传播。近年来，口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的相关研究报道比较多见[6].

1.2 分类

小核糖核酸病毒科属于小核糖核酸病毒目，同属于小核糖核酸病毒目的还有双顺反子病毒科(Dicistroviridae)，植物小核糖核酸病毒科(Secoviridae)和海洋核糖核酸病毒科.根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)关于病毒学的最新分类(截至2018年3月)，小核糖核酸病毒科病毒分为40个属94个种。这40个属为：类鸭甲肝病毒属(Aalivirus)、Ampivirus病毒属、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、Aquamavirus病毒属、禽星状病毒属(Avihepatovirus)、Avisivirus病毒属、Bopivirus病毒属、心病毒属(Cardiovirus)、Cosavirus病毒属、Crohivirus病毒属、Dicipivirus病毒属、肠道病毒属(Enterovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、Gallivirus病毒属、Harkavirus病毒属、肝病毒属(Hepatovirus)、Hunnivirus病毒属、嵴病毒属(Kobuvirus)、Kunsagivirus病毒属、Limnipivirus病毒属、Megrivirus病毒属、Mischivirus病毒属、Mosavirus病毒属、Oscivirus病毒属、Orivirus病毒属、副肠孤病毒属(Parechovirus)、Pasivirus病毒属、Passerivirus病毒属、Potamipivirus病毒属、Rabovirus病毒属、Rosavirus病毒属、Sakobuvirus病毒属、Salivirus病毒属、类肠病毒属(Sapelovirus)、西尼卡谷病毒(Senecavirus)、Shanbavirus病毒属、Sicinivirus病毒属、捷申病毒属(Teschovirus)、Torchivirus病毒属、禽脑脊髓炎病毒(Tremovirus).

该家族所有成员的特征是具有β桶形折叠的三种衣壳蛋白，由病毒编码的半胱氨酸蛋白酶进行多蛋白加工以及通过RNA依赖性RNA聚合酶与YGDD序列基序复制.这个家族包括40个属，含有94个种，但目前许多病毒正在等待分类.

2 病毒受体的概念及重要作用

病毒为征服宿主细胞已经发展出独特的机制来破坏细胞表面屏障以启动病毒感染.病毒要进入细胞内环境首先便是吸附于宿主细胞上，吸附过程可分为两种情况，一种是能够发生可逆反应的非特异性静电吸附，另一种便是不能可逆反应的特异性受体吸附.病毒受体实际上就是一种细胞表面的正常结构，本质是蛋白质，由宿主细胞的基因调控，参与正常的生理功能.受体通常介导病毒颗粒附着到宿主细胞表面并积极促进内化.但是，并非所有病毒都遵循这个过程.一些病毒利用大量表达的表面蛋白来初始附着于细胞，但需要不同的受体进入细胞.病毒与宿主受体相互作用是高度特异性的，并且对于建立病毒感染至关重要.

病毒受体的鉴定扩大了我们对病毒进入的了解，并提供了对细胞内吞途径复杂性的深入了解.它还阐明宿主中病毒感染的遗传决定因素.受体基因中天然存在的多态性可能有助于个体对病毒感染的易感性.在人群中，病毒受体基因多态性的阳性自然选择已被多种病毒所证实，这突出了它们在病毒发病机制中的重要性.病毒受体是组织和宿主嗜性的关键决定因素，受体识别充当宿主屏障，防止新出现病毒引起的人畜共患病.这是有益的，因为它可以保护我们免受致病性动物病毒的侵袭，然而，由于受体不相容性，它有时会使小动物模型的发育复杂化.因此，受体识别在创建易感动物模型方面是有价值的，这些动物模型允许我们进一步研究病毒并测试抗病毒疗法.

随着科学技术的发展，提高了病毒受体识别的灵敏度和精确度，使我们能够了解一些更复杂的病毒进入机制.几种病毒受体的鉴定已经阐明了病毒进化以获得细胞的细胞质进入的复杂的分子机制，并且这样做提供了进一步理解病毒发病机理的机会.

3 受体研究方法及意义

病毒感染细胞的第一步便是吸附宿主细胞，这一吸附的过程与细胞受体密不可分，所以要弄清病毒的作用机理，首先要研究病毒受体.随着分子生物学及其相关技术的高速发展，各种病毒受体的研究越来越深入，方法越来越多.先前人们对病毒受体只是进行定位、定性的研究，现在已经深入到分子结构和构象的研究.

3.1 亲和层析技术

亲和层析技术类似于酶联免疫吸附测定，利用病毒和细胞受体的特异性结合的这样一种分离技术便是亲和层析技术.该技术的技术路线为：首先将病毒偶联到琼脂糖载体上，作为固定相放置在层析柱中，同时将细胞膜或者整个细胞裂解；接着用裂解后的产物流过层析柱，使细胞受体蛋白与病毒进行专一性结合，非细胞受体由于不被吸附，直接流出；最后选用适当的洗脱液洗脱，洗脱下来的即为细胞受体[7].

3.2 病毒铺覆蛋白印迹技术

研究病毒受体最经典的方法——病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)，首先提取靶细胞膜蛋白，接着将提取到的细胞膜蛋白溶解物进行SDS凝胶电泳分离，将得到的蛋白条带转膜，转膜后加入纯化的病毒孵育，孵育后洗膜，洗去没有结合的病毒粒子，然后显色.该技术抗干扰、灵敏性高，但是进行蛋白质电泳时会对蛋白造成不同程度的变性[8，9].

3.3 免疫共沉淀技术(Co-IP)

免疫共沉淀技术(Co-IP)其原理是分子与抗体特异性结合，产生沉淀并提取出来进行检测，与该分子能发生特异性结合的其他分子也会被一起沉淀出来.该方法操作复杂并且敏感性不高[10].

3.4 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术(PSDT)的原理是将外源基因导入噬菌体中，使之在噬菌体的衣壳上进行表达，用以研究配体与受体之间的关系.为了使目的基因编码的蛋白能够在衣壳表面表达，研究人员会将这段基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因PⅢ和PⅧ中与衣壳蛋白融合并且表达.该方法可以快速的从大容量文库中筛选出与病毒特异性结合的蛋白，但是检测到的蛋白可能不是细胞膜受体而是细胞内蛋白，因此在该方法的基础上，还要进一步验证[11，12].

3.5 特异性单克隆抗体筛选

该方法是制备对病毒感染易感细胞有抑制作用的单克隆抗体，验证单克隆抗体与病毒是否存在一种竞争关系，如果有竞争关系，那么就能说明单抗与病毒竞争一个受体.这个单抗识别的蛋白便是细胞受体[13，14].

3.6 酵母双杂交技术

当DNA结合域和转录激活域分开时，DNA结合域还能与其调节序列结合，而转录激活域在靠近转录起点时仍能启动效应基因的转录.因此对报告基因表型进行验证，便能知道两个待检测蛋白是否发生了相互作用.该方法避免了传统体外试验中各种因素对蛋白的影响，灵敏度高且特异性强，但是容易出现假阳性或者假阴性[15].

4 各属病毒的受体研究

小核糖核酸病毒科中还有很多病毒未被分类，大多数病毒研究还处于初级阶段，并未对其受体进行深入研究.因此本文对已有相关报道的小核糖核酸病毒的细胞膜表面受体进行综述，其他未提到的小核糖核酸病毒属受体还有待研究.

4.1 口蹄疫病毒受体

4.1.1 口蹄疫病毒整联蛋白受体

在多种哺乳动物细胞上均含有αvβ3、αvβ6、αvβ1和αvβ8四种整联蛋白，它们在细胞间的结合和细胞外基质的应答中起重要作用.这四种蛋白被鉴定为口蹄疫病毒整联蛋白受体[16-20]，其通路为口蹄疫病毒结构蛋白VP1的G-H环上基序RGD与整联蛋白受体结合，该结合体利用网格蛋白介导的内吞路径感染细胞，然后利用早期核内体转运到循环核内体中释放病毒[21].

4.1.2 口蹄疫病毒硫酸乙酰肝素(HS)受体

硫酸乙酰肝素(HS)是一种硫酸葡萄胺，该受体入侵途径是HS与口蹄疫病毒结构蛋白VP3上的56位精氨酸结合，该结合体通过小窝蛋白介导的内吞途径入侵细胞.核内体中pH比较低，待口蹄疫病毒进入核内体后，低pH环境诱导病毒衣壳裂解，然后穿过核内体膜上的小孔来释放病毒遗传物质[22，23，24].

4.1.3 口蹄疫病毒未知受体

大量研究表明，除了已经发现的两类受体外，还有第三类受体的存在，这种未知受体参与了口蹄疫病毒的吸附和内化[25，26].但是这种未知受体介导的入侵路径尚不明确，有待进一步研究.

4.2 脑心肌炎病毒(心病毒属)受体

4.3 猪萨佩罗病毒(类肠病毒属)受体

当前猪萨佩罗病毒的研究主要还在流行病学方面，关于猪萨佩罗病毒的细胞受体、入侵途径和传播机制等的研究鲜有报道.目前猪萨佩罗病毒识别GD1a神经节苷脂的末端2，3糖苷键连接的唾液酸受体已有初步研究[33].

4.4 肠道病毒属受体

4.4.1 脊髓灰质炎病毒受体

脊髓灰质炎病毒受体(PVR)是免疫球蛋白超家族成员，其本质是糖蛋白，分子量为67kD[34].脊髓灰质炎病毒受体是一种跨膜蛋白，由胞浆到胞外依次是短的胞浆区，一个跨膜区，三个胞外免疫球蛋白样结构和一个假定的前导肽.脊髓灰质炎病毒进入机体后，首先与脊髓灰质炎病毒受体结合，由受体介导穿过细胞膜进入细胞，脱壳酶和受体双重作用下，病毒脱去核衣壳，进行复制、装配、释放病毒.

4.4.2 柯萨奇B组病毒受体

目前柯萨奇B组病毒受体发现有两种，分别是衰变加速因子(DAF)和柯萨奇B组病毒和腺病毒共受体(CAR，Coxsackie B virus-Adenovirus receptor)[35]，同属于免疫球蛋白超家族成员.柯萨奇B组病毒和腺病毒共受体分子量为46kDa，含有365个氨基酸，具有3个结构域，是一种I型跨膜糖蛋白；衰变加速因子是糖磷脂-磷脂酰肌醇锚着糖蛋白，其分子量为70kDa，主要存在于与血清相接触的多种细胞表面[36].柯萨奇B组病毒进入机体后，首先与衰变加速因子和柯萨奇B组病毒和腺病毒共受体结合，通过其介导进入宿主细胞进行复制、装配、释放病毒，引起发热、脑炎和心肌组织的病变[37，38].

4.5 肝病毒属受体

4.5.1 甲型肝炎病毒受体

甲型肝炎病毒(HAV)的细胞受体被命名为甲型肝炎病毒受体-1(HAV Cellular Receptor-1，HAVcr-1)，该受体不是刻意研究发现的，而是培养甲型肝炎病毒时发现的.人甲型肝炎病毒受体-1(humanHAV Cellular Receptor-1，huHAVcr-1)又称为粘蛋白域蛋白-1、T细胞免疫球蛋白域或者肾损伤分子-1，是一种含有359个氨基酸的膜结合糖蛋白，该蛋白在所有人体器官中均有表达，其中在肾脏与睾丸中蛋白表达量高，人甲型肝炎病毒受体与猴甲型肝炎病毒受体具有较高的同源性(79%).甲型肝炎病毒进入机体后，首先与甲型肝炎病毒受体-1结合，在受体的介导下，病毒粒子由于细胞发生内吞作用进入细胞内，接着细胞表壳构象发生改变，病毒脱衣壳进行复制、装配、释放病毒.

4.5.2 禽乙型肝炎病毒受体

禽乙型肝炎病毒(AHBV)的细胞受体是羧基肽酶D(gp180)，是一种跨膜蛋白，C端位于胞外，禽乙型肝炎病毒进入机体后首先与羧基肽酶D的C末端结合，从而进入细胞内环境.

4.5.3 丙型肝炎病毒

近年来，发现的丙型肝炎病毒(HCV)的受体有五种，分别是表面抗原分化簇81受体(CD81)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B type 1，SR-BI)、CLDN1(claudin-1)和OCLN(occluding)[36，39].

表面抗原分化簇81受体是四跨膜蛋白(Tetraspanin)超家族的成员，含有236个氨基酸，分子质量约为38kDa.表面抗原分化簇81受体蛋白的N端和C端都在胞浆内，有两个胞外区域，分别是EC-1与EC-2.丙型肝炎病毒与受体特异性结合可能是EC-2区域上的一个二硫键，这个机制还有待进一步验证.

低密度脂蛋白受体主要存在于肝实质细胞，其生理功能是调节血液中胆固醇水平.丙型肝炎病毒进入机体，首先与极低密度脂蛋白(VLDL)或者低密度脂蛋白(LDL)结合形成复合物，然后经由低密度脂蛋白受体介导进入细胞.

5 结语

新兴和重新出现的病毒不断威胁全球人类健康，特别是小核糖核酸病毒具有易变异的特性仅通过疫苗很难控制，因此需要灵活而快速的方法来评估哪些因素是病毒感染所必须的，通过阻断这些因素以便控制或消灭病毒。病毒感染细胞的第一步便是与细胞膜表面受体发生特异性结合，病毒侵染细胞的主要因素便是细胞表面的受体蛋白.

综上，小核糖核酸病毒科病毒受体研究显得尤为重要，但是小核糖核酸病毒科中还有很多病毒未被分类，大多数病毒研究还处于初级阶段，并未对其受体进行深入研究.因此，深入研究小核糖核酸病毒细胞膜受体的结构、构象、组织定位等生物学特性，对于研究小核糖核酸病毒的侵入机制、解释小核糖核酸病毒的宿主范围和组织嗜性现象以及制备有效的预防和治疗药物等都具有重要的意义，为病毒的防治提供一些新的思路.

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