葛胺酮-大豆卵磷脂复合物的制备、表征及体内药代动力学研究

2018-06-13邹云彭彭涛温晓雪王刚孙云波刘曙晨高月张首国王林1

生物技术通讯 2018年3期

邹云彭，彭涛，温晓雪，王刚，孙云波，刘曙晨，高月，张首国，王林1,

1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850

葛根素（puerarin）是从葛根中提取的一种异黄酮碳苷类化合物[1]，具有显著的抗心肌缺血[2]和抗脑缺血作用[3]。但是葛根素水溶性差、渗透性差，且易出现溶血副作用，极大地限制了其临床应用。3′-（二甲基氨基）甲基葛根素盐酸盐（葛胺酮，G20）是由本课题组研发的葛根素衍生物。其抗心肌缺血和脑缺血作用强于葛根素，且无溶血副作用[4-5]。但由于G20脂溶性较差且口服生物利用度低，极大地影响了其在临床上的优势。

大豆卵磷脂与药物分子的络合技术应用广泛，可以改善药物口服吸收。大豆卵磷脂是一种具有两亲性的特殊载体，是哺乳动物细胞膜的主要成分之一。它不仅可以提高难溶性药物的溶解度及药物释放速率，而且能增强药物的膜渗透性[6]。意大利学者在1987年首次制备多酚类化合物的卵磷脂复合物，该复合物显著提高了多酚类化合物的口服生物利用度[7]。迄今已有大黄酚[8]、没食子酸[9]、黄芩苷[10]、氧化苦参碱[11]等多种中药单体制备卵磷脂复合物，改善了活性中药成分在生物体内的吸收。在此，我们采用L9（34）正交设计优化G20-大豆卵磷脂复合物的制备方案，对所得复合物进行X线衍射分析，评估大鼠口服G20和G20-大豆卵磷脂复合物后的生物利用度

1 材料

雄性SD大鼠，体重（250±15）g，购自军事医学研究院实验动物中心；G20由本实验室合成，HPLC检测含量高于99%；对羟基苯甲醛、柠檬酸、大豆卵磷脂购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯产品；Agilent1100高效液相色谱仪为安捷伦科技（中国）有限公司产品；旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品。

2 方法与结果

2.1 卵磷脂复合物的制备

取 G20（100.0mg，217.8 μmol）、大豆卵磷脂［169.9mg，217.8μmol（天然卵磷脂的平均相对分子质量为780，此时G20与大豆卵磷脂的摩尔比为1∶1）］加到2.5mL有机溶剂中，30℃搅拌2 h，浓缩得到淡黄色固体，加入氯仿溶解该固体，抽滤除去没有反应的G20，再浓缩干燥过夜，得到G20-大豆卵磷脂复合物。

2.2 复合率的测定

G20极易溶于水，难溶于氯仿，而大豆卵磷脂和G20-大豆卵磷脂复合物都易溶于氯仿。在G20和大豆卵磷脂反应后,浓缩得到淡黄色固体,用氯仿溶解该固体中的大豆卵磷脂及所生成的卵磷脂复合物，抽滤得到沉淀，反复用氯仿洗涤沉淀，干燥后称重，该沉淀即为不溶于氯仿的G20。按照下式计算药物与卵磷脂的复合率：

2.3 单因素考察

2.3.1 选择最佳反应溶剂选取甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环作为反应溶剂，其他反应条件如2.1（药脂摩尔比为1∶1，反应温度为30℃，反应时间为2h，反应溶剂为2.5mL）。以G20-大豆卵磷脂复合物的复合率为实验指标，寻找最佳反应溶剂。结果显示，上述溶剂的复合率分别为（23.03±2.56）%、（46.07±3.26）%、（26.07±1.46）%、（28.83±0.60）%、（23.73±1.27）%、（18.97±1.66）%、（34.03±2.82）%（n=3）。可以看出以乙醇为反应溶剂的复合率最高，故反应溶剂选择乙醇。

2.3.2 选择最佳药脂摩尔比研究不同药脂摩尔比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3）对 G20-大豆卵磷脂复合物复合率的影响，选定乙醇为反应溶剂，其他反应条件如2.1。复合率分别为（18.20±0.21）%、（27.57±0.10）%、（57.00±0.06）%、（54.73±0.14）%（n=3）。可以看出，随着大豆卵磷脂比例的提高，复合率大幅度上升，但是当药脂摩尔比为1∶2时，继续增加大豆卵磷脂比例，复合率没有进一步提高。大豆卵磷脂含量过高会导致复合物的黏度增大，因此选取药脂摩尔比为1∶2。

2.3.3 选择最佳溶剂量研究不同溶剂体积（2.5、5、10、15、20、30、40、60mL）对G20-大豆卵磷脂复合物复合率的影响，选定乙醇为反应溶剂，其他反应条件如2.1。复合率分别为（34.27±0.24）%、（37.80±0.04）%、（55.27±0.20）%、（61.70±0.08）%、（71.70±0.12）%、（75.47±0.10）%、（80.03±0.13）%、（81.33±0.10）%（n=3）。可以看出，随着乙醇体积的增大，复合率大幅度上升，当无水乙醇为60mL时复合率最大。

2.3.4 选择最佳反应时间研究不同反应时间（2、3、4、5h）对 G20-大豆卵磷脂复合物复合率的影响，选定乙醇为反应溶剂，其他反应条件如2.1。复合率分别为（27.73±0.09）%、（28.33±0.06）%、（27.17±0.13）%、（32.17±0.12）%（n=3）。可以看出，反应时间对复合物复合率的影响较小，为了节省反应时间，选取反应时间为2h。

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2.4 正交实验优化实验方案

通过单因素考察可以看出，对复合率影响较大的实验因素有药脂摩尔比、溶剂量、反应温度，而反应时间对复合率影响不大。采用L9（34）正交设计表，以复合率为指标，对药脂摩尔比（A）、溶剂量（B）、反应温度（C）进行三因素三水平正交实验优化[12]，反应时间均为2h。采用SAS9.1统计软件进行数据分析。实验结果见表1，方差分析见表2。3种实验因素对复合率的影响顺序为药脂摩尔比（A）＞溶剂量（B）＞反应温度（C），药脂摩尔比对复合率的影响最大。最佳实验方案确定为A2B3C3，即G20与卵磷脂的投料摩尔比为1∶1.5，溶剂量为40mL，反应温度为50℃。

2.5 最佳反应条件的验证试验

根据正交设计结果，采用最佳工艺制备G20-大豆卵磷脂复合物，测得3批样品的复合率均为100%，说明该制备工艺稳定可靠，重现性强。

2.6 X线衍射分析（XRD）

如图1所示，用X线衍射法评价G20在G20-大豆卵磷脂复合物中的物理状态。G20粉末的XRD图存在特征结晶衍射峰，而大豆卵磷脂的XRD图呈现一个宽峰，没有任何特征结晶衍射峰存在。G20与大豆卵磷脂的物理混合物（药脂的摩尔比为1∶1.5）的XRD图存在明显的G20的特征结晶衍射峰，这说明G20以晶体形式存在于该物理混合物中。而在G20-大豆卵磷脂复合物的XRD图中，不存在任何G20的特征结晶衍射峰，这说明G20-大豆卵磷脂复合物中没有任何G20晶体存在。在G20-大豆卵磷脂复合物中，G20可能以分子或非晶体的形式存在，G20与卵磷脂复合物存在相互作用力，如范德华力、偶极-偶极相互作用、氢键[13]。

2.7 药动学研究

2.7.1 灌胃供试液配制取G20200.0mg,加入8mL超纯水,超声波2min，配制成含G2025 mg/mL的G20溶液。取G20-大豆卵磷脂复合物680.0mg，加入8mL0.5%羧甲基纤维素钠溶液，超声波2min，配制成含G2025mg/mL的G20-大豆卵磷脂复合物混悬液。

表1 采用L9（34）正交设计优化G20卵磷脂复合物制备方案

表2 方差分析

图1 大豆卵磷脂（A）、G20（B）、物理混合物（C）和G20-大豆卵磷脂复合物（D）的XRD图

2.7.2 标准曲线绘制与方法学考察精密吸取150μL血浆样品于5mLEP管中，加入7.5μL适当浓度的G20溶液和7.5μL320μg/mL对羟基苯甲醛溶液（内标），简单振摇后加入135μL 6%高氯酸水溶液沉淀蛋白，涡旋振荡3min后超声波5min，9500r/min离心15min，吸取全部上清液，过 0.45 μm 微孔滤膜，得到 0.1、1、4、10、40、100、140、200 μg/mL的G20血浆溶液（该溶液中内标物浓度为8μg/mL）。

HPLC采用Venusil-ASBC18色谱柱（250mm×4.6 mm，5 μm），柱温25℃，流动相为甲醇-水（含0.2%柠檬酸，20∶80），检测波长250nm，进样量60 μL。以G20与对羟基苯甲醛峰面积之比为纵坐标（AG20/A内标）、G20浓度为横坐标（C）绘制标准曲线，得回归方程AG20/A内标=0.24C+0.014（r=0.999949）。

配制1、10、100μg/mL的质控样品各5份，按上述血浆样品处理方法处理，每天HPLC测定一次，连续测定3d，考察日内和日间精密度。结果表明，3种质控样品的日内精密度RSD（n=5）分别为4.42%、2.87%、1.10%，日间精密度RSD（n=15）分别为4.07%、3.10%、2.95%，回收率（n=5）分别为（106.58±4.71）%、（99.55±2.85）%、（98.11± 1.08）%。长期冻融稳定性试验显示将G20血浆样品于-20℃储存15d，G20血浆样品稳定性好。

2.7.3 G20与G20-大豆卵磷脂复合物的大鼠生物利用度测定将12只SD大鼠随机分为2组，每组6只，实验前禁食12h，分别灌胃给予50mg/mL（按G20量计算）G20和G20-大豆卵磷脂复合物，灌胃后 5、15、30、45、60、90min和2、3、5、8、24h用肝素钠润洗过5mLEP管，尾静脉取血0.6mL（约15滴）,轻轻振摇后1980r/min离心15 min得到含药血浆[14]，-20℃冻存待用。

精密吸取150μL上述含药血浆至5mL离心管中，加入15μL160μg/mL对羟基苯甲醛溶液，简单振摇后加入135μL6%高氯酸水溶液沉淀蛋白，涡旋振荡3min后超声波5min，9500r/min离心15min，吸取全部上清液，过0.45μm微孔滤膜，得到待测样品稀释液（含内标物浓度为8μg/mL），取稀释液60μL进样分析。

药时曲线如图2，相应药动学参数见表3。当SD大鼠灌胃给予G20及其卵磷脂复合物后，血药浓度达峰时间（Tmax）从（0.555±0.473）h显著增加到（1.250±0.250）h（P＜0.05），说明制成磷脂复合物之后，G20的作用时间延长。药时曲线下面积（AUC）由（3.139±0.844）μg/（h·mL）增大到（5.025±0.170）μg/（h·mL）（P＜0.01）。G20-大豆卵磷脂复合物的AUC是G20的1.6倍，表明采用磷脂复合物技术可以显著提高G20的口服生物利用度。

3 讨论

正交设计是一种系统的统计方法，它能最大限度地提高测试覆盖率并减少测试的数量[15]，适用于优化实验方案。Liu等[16]通过L9（34）正交设计考察大豆卵磷脂的浓度、3种配料（大豆卵磷脂、胆固醇和脱氧胆酸钠）比例对齐墩果酸脂质体包封率的影响，优化了齐墩果酸脂质体制备方案，使药物包封率达到90%以上。本研究以G20与大豆卵磷脂的复合率为评价指标，在单因素试验的基础上采用正交试验设计，使复合率达到100%。该制备工艺条件稳定，操作简便，所得卵磷脂复合物为粉末状，易于操作。

一些多酚类、黄酮类和萜类等植物活性成分因膜透性差、口服生物利用度低而使其应用受到限制[17]。卵磷脂与这些植物成分进行络合，可以改善其生物利用度，通过磷脂复合物独特的释药模式延长药物作用时间[18]。在本研究中，SD大鼠分别灌胃给予G20及其卵磷脂复合物，与G20相比，其卵磷脂复合物的口服生物利用度提高了160%。本研究结果可为进一步研发G20口服制剂提供参考。