富纳米硒沼泽红假单胞菌的肝保护作用研究

2018-06-13王越李保珍李丹王兰

生物技术通讯 2018年3期

王越，李保珍，李丹，王兰

山西大学生命科学学院，山西太原 030006

受环境污染和密集养殖模式的影响，畜禽养殖中动物的肝病发病率极高，而畜产肉类又是市场上最常见的肉类，因此，减少畜产动物肝病的发病率，寻找合适的畜禽动物的护肝药物尤为重要。硒是动物体必需的营养元素，具有多种生物学功能，包括对肝脏的保护作用。由于硒的安全剂量较难把握，故在畜禽养殖中的应用受到了一定的限制。张劲松等[1]利用体外化学合成的方法制备了红色纳米单质硒，这种硒形式具有低毒性、高活性的特点。为了得到高效低毒、制备过程绿色环保、价格低廉的硒产品，利用微生物将无机硒转化为毒性较低的纳米单质硒成为目前研究的热点。已有研究发现，多种微生物能够将亚硒酸盐还原为红色单质硒[2-7]。

光合细菌是地球上最早出现的、具有原始光能合成体系的厌氧原核生物，广泛存在于地球生物圈，是一种生命力极强的菌体。近年来，随着人们对光合细菌研究的不断深入，光合细菌在畜禽养殖、水产养殖、农作物种植及污水治理方面表现出很高的应用价值[8-9]。其中，在我国沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）已获准用作畜禽养殖饲料添加剂生产菌种。研究表明，纳米硒（seleniumnanoparticles，SeNPs）具有肝保护活性[3]。本实验室前期获得了一株沼泽红假单胞菌，能够将亚硒酸盐还原为红色SeNPs[1]。前期研究发现，该生物源SeNPs也具有肝保护的生物学效应。

鉴于此，在本研究中，我们拟通过建立四氯化碳（CCl4）小鼠肝损伤模型，探讨富纳米硒沼泽红假单胞菌（SeNPs-enrichedR.palustris，SR）对肝损伤小鼠肝的保护作用，为开发新的畜禽保肝制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠，18～22g，90只，清洁级，购于山西医科大学动物中心，全价营养饲料喂养，自由进食、饮水。沼泽红假单胞菌N菌株保藏于山西大学生命科学学院[10]。

亚硒酸钠（分析纯），CCl4（分析纯），氯化钠（分析纯），苏木精，二甲苯和植物油等。

1.2 富纳米硒沼泽红假单胞菌的制备

依据Li等[11]报道的方法，在亚硒酸钠添加量为2.0mmol/L、培养基初始pH值为7.0、接种量15%的条件下制备SR菌粉和沼泽红假单胞菌菌粉，并测得SR菌粉中含硒量为28.3%[12]。

1.3 实验动物饲养及肝损伤模型的建立

将90只昆明小鼠于实验室（温度18～20℃，光照为12h∶12h）暂养1周，自由饮食。动物分组及给药剂量见表1。

对照（Control）组和模型（Model）组小鼠灌胃生理盐水，其他组小鼠灌胃相应剂量的SR菌液和沼泽红假单胞菌菌液，连续给药14d后，禁食不禁水24h，第15dControl组和H-SRControl组一次性腹腔注射植物油10mL/kg，其他组一次性腹腔注射1%的CCl410mL/kg，24h后处死小鼠取材。

表1 SeNPs对小鼠肝损伤保护作用实验动物分组及给药剂量

1.4 取材

将每只小鼠称重后，立即解剖取肝脏，用冷的PBS反复冲洗，用滤纸吸干水分，称重。其中，每组随机选取2只小鼠解剖取肝脏，PBS冲洗后迅速拍照，在肝脏右叶距边缘0.5cm处取1cm×0.2cm×0.2cm的肝组织，置10%甲醛中固定。

1.5 观察手段

1.5.1 体视显微镜观察肝组织整体形态取出新鲜的肝组织置于培养皿中，用PBS冲洗后浸泡在PBS中，于体视显微镜下观察肝组织外部形态。

1.5.2 光镜观察组织细胞切片从甲醛固定液中取出肝组织，流水冲洗过夜，分别置于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋；在Leica石蜡切片机（RM2255）上连续切片，厚度6μm；切片经脱蜡和水化后用蒸馏水清洗，HE染色，观察组织的病理学变化[13]。

1.5.3 数据分析数据用SPSS17.0进行统计分析，以x±s表示。采用Origin8.5软件制图。

2 结果与讨论

2.1 实验小鼠观察

Control组小鼠皮毛光泽，活动正常，饮食正常，二便正常；SR各剂量组及R.palustris各剂量组小鼠皮毛光泽鲜亮，行动敏捷，较为活泼，正常饮食，二便正常。但是，注射CCl4后，各组小鼠出现不同程度的精神萎靡、反应迟钝现象。Model组小鼠外表变化最明显，皮毛粗糙凌乱，毛色发暗，大便稀软，表明CCl4对机体产生很大的损伤作用。R.palustris各剂量组与Model组的小鼠表现相似，SR各剂量组较Model组的小鼠活泼且皮毛较顺，表明SR对小鼠具有一定的保护作用。

2.2 富纳米硒沼泽红假单胞菌对肝损伤小鼠肝脏指数的影响

肝脏指数是肝损伤的指标之一，能够反映肝组织肿胀程度和炎性浸润。CCl4肝损伤通常能够导致肝细胞肿大、气球样变等，这些症状会使得肝组织重量增加，即肝脏指数增大[14]。由图1可知，H-SRControl组与Control组小鼠肝脏指数相比差异不显著（P＞0.05），说明本实验中最大剂量SR不会导致小鼠肝脏指数增大，对小鼠没有明显的损伤。Model组与Control组小鼠肝脏指数相比明显升高，呈极显著性差异（P＜0.01），表明CCl4处理后小鼠肝脏损伤明显。R.palustris的3个剂量组和L-SR组与Model组肝脏指数相比均差异不显著（P＞0.05），而当 SR 菌液中含硒为 100和 200 μg/kg时，肝脏指数降低，分别与Model组相比呈显著或极显著差异（P＜0.05，P＜0.01），表明 SR能够抑制炎症反应所致的肝脏重量增加和体积增大，具有一定的抗炎和抗急性肝损伤的作用，而沼泽红假单胞菌几乎没有相应的保护作用。这一结果与一些化学方法合成的SeNPs的研究相一致[15-17]。

2.3 富纳米硒沼泽红假单胞菌对肝损伤小鼠肝脏形态的影响

实体解剖镜观察发现，Control组（图2，A列）小鼠肝脏表面颜色略呈深红色，光泽度好，表面光滑，质地柔软，触感新鲜，边缘整齐，切割较顺畅。H-SRControl组（图2，C列）小鼠肝脏形态与Control组基本一致。Model组（图2，B列）小鼠颜色发灰，色泽较暗，表面较钝，质地发硬，边缘不整齐，切割时阻力较大，在肝脏表面可看到出血点。3个剂量的R.palustris处理组（图2，D～F列）出血点较深，与Model组情况基本相似。不同剂量SR组（图2，G～I列）出血点症状减轻，表明SR能够缓解CCl4肝损伤小鼠肝脏表面出血点。

2.4 富纳米硒沼泽红假单胞菌对肝损伤小鼠肝组织细胞显微结构的影响

Control组（图3A）小鼠肝组织细胞结构正常，肝细胞索排列规则，肝小叶结构清楚；肝细胞形态正常，呈多边形，细胞核居中，核仁清晰，肝血窦及汇管区无异常，无细胞水肿、坏死和炎细胞浸润现象。Model组（图3B）肝小叶边界不清晰，肝细胞索紊乱，中央静脉腔周围大片坏死且有大量炎细胞浸润；细胞体积增大，水肿较为明显，胞浆不匀，细胞出现疏松化、气球样变，出现中性粒细胞，并且有大量核固缩现象。H-SRControl组（图3C）肝细胞索排列整齐，肝小叶结构清晰，肝细胞形态基本正常。3个R.palustris组（图3D～F）有不同程度的变化，如肝小叶边界不清晰，肝细胞索紊乱，细胞坏死，炎细胞浸润，细胞水肿，细胞体积增大，胞浆不匀，细胞疏松化。L-SR组（图3G）肝细胞索结构中央静脉腔周围有细胞坏死现象，但坏死区域较模型组小，炎细胞浸润减少，依然有细胞水肿、细胞体积增大、细胞疏松化的现象。M-SR组（图3H）观察到肝细胞索结构，肝小叶边界开始变得清晰，胞质变得均匀，中央静脉腔周围仅有点状坏死，有少量炎细胞浸润，细胞水肿较轻。H-SR组（图3I）肝小叶边界较为清晰，肝细胞索排列基本正常，肝细胞质较为均匀，基本看不到疏松化，也没有炎细胞浸润，仅中央静脉腔周围散在点状坏死，有轻微细胞水肿现象。组织病理学检测表明，SeNPs能够在组织水平上减轻肝细胞坏死、炎细胞浸润、细胞疏松化、细胞水肿等病理症状。由此推断，SR在组织细胞水平上对CCl4所致肝损伤小鼠有保护作用。