利用酵母双杂交系统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选与JNKK2相互作用的蛋白

孙杰，常正尧，张晓明，王晶

1.军事科学院 军事医学研究院 毒物药物研究所，北京 100850；2.解放军第302医院，北京 100039；3.空军军医大学，陕西 西安 710032

c-JunN 端激酶激酶 2（c-JunN-terminalki⁃nasekinase2，JNKK2）是 c-JunN端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）的上游激酶，也被称为丝裂原激活的蛋白激酶激酶7（mitogen-activated proteinkinasekinase7，MKK7），其调控着机体内众多生理进程，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡等[1-2]。既往研究及我们课题组前期的工作发现，JNKK2分子参与调控多种肿瘤的恶性增殖[3-6]。然而目前有关JNKK2在肝脏中的功能及调节机制研究还较少。酵母双杂交系统是一种可以快速、直接分析已知蛋白之间相互作用的常用方法，可用于分离与已知蛋白存在相互作用的配体，并明确其编码基因。该系统具有简便、高效、灵敏等特征，并能反映不同蛋白在细胞内的相互作用，常被用于基因的功能研究[7-8]。因此，为了探究JNKK2在肝脏中的调节机制，我们利用酵母双杂交系统，从人胎肝cDNA文库中筛选出能与JNKK2相互作用的蛋白，期望找到调控JNKK2-JNK信号通路的新分子，进而为更好地理解JNK信号通路在肝脏中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

JNKK2KM质粒、GFP-JNKK2质粒由本室张纪岩教授提供[4]；酵母菌株 AH109（MATa），诱饵载体质粒pGBKT7，文库载体质粒pGADT7，对照质粒 pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T、pCL1，预转化的人胚胎肝脏cDNA文库，营养缺陷型培养 基 ，X-α-gal，抗 GAL4DNA-BD 多 抗 购 自Clontech公司；YPDA培养板购自青岛海博生物科技有限公司；鲑鱼精DNA（CarrierDNA）、玻璃珠、3-AT、PEG3350、溶壁酶、苯甲脒、DMSO、PMSF、抗Flag标签抗体购自Sigma公司；无氨基酸酵母氮源（YNB）购自Difco公司；蛋白A/G琼脂糖珠购自SantaCruz公司；DNA聚合酶Pyrobest及其缓冲液、dNTPs购自TaKaRa公司；各种限制性内切酶及相应缓冲液购自NewEnglandBiolabs公司；其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.2 pGBKT7-JNKK2KM诱饵载体的构建与鉴定

根据JNKK2编码区序列设计两端分别带有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的特异性引物JNKK2-P5 （5′-CCGGAATTCATGGCGGCGTCCTCCCTGGA ACAG-3′）和 JNKK2-P3（5′-CGCGGATCCTTACTC AGTCTTCGCCATGACATC-3′）。以 JNKK2KM 质粒为模板，PCR扩增JNKK2KM编码区片段（PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火 40s，72℃延伸 90s，30个循环；72℃延伸10min）。PCR产物片段与pGBKT7空载体质粒经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，用DNA连接酶于16℃连接，然后转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆进行菌落PCR并提取质粒进行双酶切后，经12g/L琼脂糖电泳分析，对PCR及酶切鉴定均为阳性的克隆进行基因测序鉴定。

1.3 诱饵质粒的转化及表达鉴定

将pGBKT7-JNKK2KM转化AH109酵母菌（参照Clontech MatchmakerPretransformed Libraries UserManual），以AH109/pGBKT7和AH109空菌分别作为空载体对照和空白对照，涂布SD/-Trp或YPDA平板，置30℃培养箱中培养3～5d，从平板上分别挑取AH109/pGBKT7-JNKK2KM及AH109/pGBKT7转化的单克隆，接种至SD/-Trp液体培养基中，以未转化质粒的AH109菌落接种至YPDA培养液中，30℃、250r/min振荡培养20h，通过免疫印迹验证BD-JNKK2KM融合蛋白的表达[3-5]。

1.4 酵母双杂交系统从人胎肝cDNA文库中筛选与JNNK2相互作用的蛋白

挑取新鲜含诱饵基因的酵母菌落至50mL SD/-Trp培养基中，充分混匀，30℃、250～270r/min培养 16～20h至D600nm＞0.8；1000r/min离心菌液 5 min，弃上清，用 4～5mLSD/-Trp培养基重悬，调整酵母细胞浓度，使终浓度大于1×108/mL。室温水浴解冻1支含预转化文库的Y187酵母菌液，将上述过夜培养的5mLAH109诱饵菌液与1mL预转化文库菌液在2L无菌烧瓶中混匀，加入2×YPDA/Kana培养基（含50g/mL卡那霉素），定容至 50mL；30℃、30～50r/min 培养 20～24h；离心收集交配液，沉淀用10mL0.5×YPDA/Kana培养基重悬。用无菌涂棒，按200μL/平板，均匀涂布交配液到 55块 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（QDO）四缺陷选择培养板上（150mm），30℃恒温培养8～21d；同时按比例稀释交配液分别涂于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/Trp平板上（100mm），30℃恒温培养3～5d，计数菌落数，计算交配效率。

1.5 阳性克隆的分离与验证

将上述可见克隆分别用无菌牙签挑出，在SD/-Leu/-Trp平板上划线，分离单克隆；分别从每块SD/-Leu/-Trp板上挑取2个单克隆，涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal（加入合适浓度的3-AT）培养板上；30℃培养 48～72h；蓝色菌落为阳性结果，阴性结果呈粉红色；选取阳性克隆再重复分离培养2～3轮。取3轮均变蓝的阳性克隆，进行扩增、抽提酵母质粒（按照Tiangen酵母质粒提取试剂盒说明书），PCR鉴定。同时PCR阳性的克隆酵母质粒转化大肠杆菌DH5α宿主菌，涂在含氨苄青霉素（Amp）的LB培养板上，37℃倒置培养12h，挑取单克隆，用含氨苄青霉素的LB培养基培养，提取大肠杆菌质粒；用HindⅢ限制性酶酶切鉴定。

1.6 阳性克隆基因测序与分析

利用文库载体pGADT7对应的常规AD测序引物对获得的阳性克隆质粒进行测序，上游引物为 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC CC-3′，下 游 引 物 为 5′-GTGAACTTGCGGGGTTTT TCAGTATCTACGAT-3′）。 测 得 的 DNA 序 列 用DNAMAN软件进行编辑，删除载体序列后剩余部分为插入文库基因；再利用NCBI网站BLASTN程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn）搜索同源序列并记录，优先选取同源性高且经过人工注释的序列；序列比对后，对相位正确的cDNA进一步分析编码蛋白的来源、功能等相关信息，去除公认的假阳性蛋白如线粒体蛋白、细胞骨架等。

1.7 免疫共沉淀验证阳性克隆与JNKK2蛋白的相互作用

挑取阳性克隆基因，构建到pcDNA3.1（-）真核表达载体上，用LipofectAMINE2000分别将1 μgORF60、GNB2L1、UBA3表达质粒及pcDNA3.1（-）空载体质粒转染293T细胞，同时共转1μg GFP-JNKK2质粒；用预冷的Co-IP裂解液裂解细胞，裂解液加入1μLM2抗Flag抗体及20μL蛋白A/G琼脂糖珠，在旋转混合仪上于4℃旋转过夜；用预冷的Co-IP裂解液洗蛋白A/G琼脂糖珠3～5次，弃上清；加入20 μL2×SDS上样缓冲液，进行蛋白电泳和免疫印迹检测。

2 结果

2.1 pGBKT7-JNKK2KM诱饵载体构建

构建好的载体经菌落PCR（图1A）及EcoRⅠ/BamHⅠ酶切（图1B）均能得到1200bp的JNKK2 DNA插入片段，测序后进行序列比对，发现与JNKK2KM基因序列相同，表明诱饵质粒pGBKT7-JNKK2KM构建成功。

2.2 诱饵AH109酵母菌重组子的鉴定

挑出诱饵酵母克隆，培养扩增后提取酵母质粒，PCR鉴定重组质粒，3个克隆在1200bp处均有JNKK2KM目的条带，表明转化成功（图2A）。提取含有重组转化子的AH109菌总蛋白进行蛋白电泳，再用抗GAL4DNA-BD抗体检测诱饵蛋白的表达，结果显示在相对分子质量73×103处有BD-JNKK2融合蛋白的表达（图2B），表明含诱饵重组子的AH109酵母菌构建成功。

图1 诱饵载体pGBKT7-JNKK2的构建

图2 诱饵蛋白的表达检测

2.3 重组诱饵表达质粒pGBKT7-JNKK2KM毒性与自我激活性检测

将上述重组成功的pGBKT7-JNKK2KM与空载体pGBKT7分别转入AH109酵母菌，观测其在SD/-Trp平板上生长状况。结果显示含诱饵质粒的AH109酵母菌在SD/-Trp上生长良好，二者生长速度相近、克隆大小相当，表明诱饵质粒对宿主酵母没有明显毒性（图3A）。同时自我激活实验显示AH109/pGBKT7-JNKK2KM在SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal平板上不能生长，也不能使X-α-Gal平板变蓝（图3B），排除了pGBKT7-JNKK2K具有自激活宿主菌AH109的作用。说明构建的诱饵表达载体pGBKT7-JNKK2KM可用于酵母双杂交系统，通过文库筛选相互作用蛋白。

2.4 cDNA文库交配效率计算

交配液涂板前，取出10μL按表1中比例稀释，取出100μL分别接种至SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp平板，倒置培养克隆，生长计数见表1。已知2个交配伴侣的各自活力大小，较少的一方处于“限制性位置”。本实验中交配效率（二倍体数/限制方菌落数×100%=664/1469×100%=45.2%）远高于2%的最低筛选要求。

2.5 阳性克隆的分离与验证

AH109/pGBKT7-JNKK2KM与Y187文库酵母菌接合培养，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/平板上陆续收集＞2mm的酵母菌落，共计120个。经SD/-Leu/-Trp板划线分离，挑取出3个克隆再涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal或 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/H2O平板上进行验证，变蓝色为阳性克隆（图4A）。阳性克隆再次划线分离与验证2～3次，最后选取每次验证均变蓝色的克隆32个。提取酵母质粒，用pGADT7载体对应的常规AD引物做PCR鉴定，获得11个阳性克隆，后经将酵母质粒转化大肠杆菌DH5α后，提取大肠杆菌质粒，用HindⅢ酶切鉴定，结果显示11个克隆酶切结果均为阳性（图4B）。

2.6 阳性克隆基因序列的测定与分析

用pGADT7载体对应的常规AD测序引物[9]对阳性克隆进行测序，分析插入文库cDNA序列。序列结果用NCBI的BLAST在线比对工具进行比对。把测序结果中相位正确的克隆确认为真正的阳性克隆，最终确定11个阳性克隆中有3个为已知的编码基因（表2）。经序列比对发现，6号克隆与泛素样修饰物激活酶3（UBA3）编码区1335～1392位匹配，9号克隆与3号染色体开放读框60（ORF60）的CDS区完全匹配，25号克隆与鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β多肽2样蛋白1（GNB2L1）编码区380～1060区匹配。以9号克隆质粒为模板调取ORF60全长编码序列，以25号克隆为模板调取GNB2L1C端681bp序列（GNB2L1C）。考虑到UBA3匹配序列较短，我们全合成UBA3C端1102～1392位291bp序列（UBA3C）。为便于研究以上调取的基因，我们在N端均加入Flag多肽标签，并克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）上。

图3 诱饵蛋白的毒性与自激活性检测

表1 交配液按比例稀释后在不同平板上克隆情况

2.7 免疫共沉淀验证阳性克隆与JNKK2蛋白的相互作用

分别转染 ORF60、GNB2L1C、UBA3C 质粒到293T细胞，同时共转GFP-JNKK2质粒，共培养24h后提取细胞蛋白，用Flag抗体M2免疫沉淀目的蛋白，用兔抗人JNKK2抗体检测相互作用条带。结果如图5所示，3个克隆均能不同程度地沉淀出GFP-JNKK2蛋白条带，而空载体对照则没有沉淀条带，表明克隆均能与JNKK2蛋白在哺乳动物细胞内相互结合。

图4 初筛克隆的验证

表2 筛选文库阳性克隆编码基因信息

3 讨论

酵母双杂交系统是分析蛋白相互作用强有力的研究方法之一，作为筛选相互作用蛋白的工具得到了广泛应用[7-8]。本研究以JNKK2KM分子为“诱饵”，应用酵母双杂交系统对人胎肝文库进行筛选，初步筛选出120个克隆，后经多轮筛选，合并重复序列，最终筛选出11个阳性克隆。质粒测序后进行序列比对分析，得到3个编码基因ORF60、GNB2L1、UBA3。经免疫共沉淀实验验证，3种蛋白均可以与JNKK2蛋白发生相互作用。

ORF60属于线粒体复合物Ⅰ家族，相关研究较少，仅有的几篇报道表明其对线粒体组装至关重要；另有研究表明新生儿氧化磷酸化失能综合征（disordersoftheoxidativephosphorylation，OX⁃PHOS）与其功能突变密切相关[10]。ORF60与JNKK2相互作用的生物学意义仍待进一步挖掘。

GNB2L1属于Gβ样支架蛋白[11-12]，相对分子质量约为36×103，其编码基因位于第5号染色体的q35.3区。GNB2L1能激活蛋白激酶C（PKC），又称为活化的蛋白激酶C受体1（receptorofacti⁃vatedC-kinase1，RACK1）。已发现能与GNB2L1结合的蛋白有近140种，其中包括许多重要的炎性信号转导分子，如 PKC、MKK7、Src、PDE4D5、PI3K等[12-14]。GNB2L1作为接头蛋白，参与调控细胞生长、凋亡、迁移、分化等过程，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用[12-13]。人非小细胞肺癌中GNB2L1的mRNA水平比正常肺组织高4倍，在结肠癌中的水平比正常结肠组织高近20倍[15]。GNB2L1还在口腔鳞癌、乳腺癌和肺腺癌中高表达[16-18]。近期，顾建新课题组发现肝细胞癌组织中GNB2L1异常高表达，且GNB2L1与不良预后呈正相关[19]。提示GNB2L1很可能通过与JNKK2的相互作用来影响JNK活性，从而促进肿瘤发生。

图5 免疫共沉淀验证阳性克隆与JNKK2蛋白的相互作用

UBA3是泛素化样修饰E1蛋白家族成员，通过结合β淀粉样蛋白前体蛋白结合蛋白（amyloidbeta precursorproteinbindingprotein，APPBP1）形成异二聚体，进而激活对泛素样蛋白NEDD8（neuralpre⁃cursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated 8）的修饰作用，NEDD8修饰（neddylation）的功能主要体现在调节蛋白质之间的相互作用、调节转录因子的活性以及拮抗泛素化等。已有研究表明ned⁃dylation系统参与调控多种肿瘤的恶性进程：免疫组化显示肝内胆管癌样本中有2/3表现出neddylation E1酶（NAE1，UBA3）、E2酶（UBC12）及NEDD8高表达[20]；人恶性胶质瘤中neddylation通路高度活化，与疾病的恶性程度正相关[21]；人肺腺癌和鳞状细胞癌中neddylation通路同样高度活化[22]。Neddylation抑制剂MLN4924可以导致肿瘤细胞S期DNA合成紊乱，从而引起肿瘤细胞凋亡，具有很好的肿瘤治疗前景，目前已进入临床试验阶段[23]。以上提示，UBA3与JNKK2相互作用可能参与调控neddylation修饰过程，与肝癌的发生发展相关。

综上，我们通过酵母双杂交系统筛选出调控JNKK2-JNK通路的蛋白分子，针对所筛选的蛋白与JNKK2间相互作用，及该作用在肿瘤发生发展中所发挥的病理生理学意义的研究，具有很好的研究价值。后续希望能深入探讨JNKK2与新筛选蛋白间相互作用的病理生理学意义，更好地理解调控JNK-JNKK2通路的分子机制，为发现新的抗肝癌靶点奠定基础。