苦玄参提取物中苦玄参苷ⅠA质量控制方法的建立

2018-06-13刘妍璨王秋华黄宏业段群棚林昌华蒋家霞胡庭俊

畜牧与饲料科学 2018年5期

刘妍璨，王秋华，黄宏业，段群棚，林昌华，蒋家霞，张宁，郭旋，胡庭俊，何颖

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西南宁 530003；3.广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；4.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司，广西柳州 545112；5.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西南宁 530022）

苦玄参是玄参科植物苦玄参（Picria fel-tarrae）的干燥全草，别名苦草、蛇总管、四环素草。其味苦，性寒，具有清热解毒、消肿止痛的功能［1］，是广西地区最有特色的中草药之一。现代药理研究表明：苦玄参具有中枢镇静、镇痛和安定作用［2］，也有较好的抗炎、解热［3-6］和广谱抗菌、抗肿瘤等作用［7-8］。笔者所在课题组在前期研究中发现，将苦玄参提取物作为广西麻鸡饲料添加剂，可以显著提高广西麻鸡的生长性能、抗氧化性能和免疫器官指数，并且对停用后的鸡只生长还具有明显的促进作用［9-10］。苦玄参的有效成分主要为四环三萜苷类，其中又以苦玄参苷ⅠA和ⅠB为主［11-12］。为更好地控制苦玄参提取物的质量，保证临床疗效，应建立定性鉴别和定量测定方法。该研究在参考相关文献报道［13-14］的基础上，采用薄层层析技术（TLC）对苦玄参提取物中的苦玄参苷ⅠA（下文简称ⅠA）进行定性鉴别，利用高效液相色谱法（HPLC）对其进行定量分析，以期为提高和修订ⅠA的质量控制标准提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：LC-20A，日本岛津公司）；电子分析天平（型号：BP211D，德国赛多利斯集团）；超声仪（型号：B3200S-T，必能信超声有限公司）；全自动薄层板器（型号：939，重庆南岸贝尔德仪器技术厂）；色谱柱［型号：Waters Symmetry C18（4.6×250 mm，5 μm），美国 Waters公司］。

1.2 主要试剂

ⅠA对照品（批号：111745-200501，购于中国食品药品检定研究院）；苦玄参对照药材（批号：121018-200904，购于中国食品药品检定研究院）；硅胶G（化学纯，购于南宁恒鑫生物有限公司）；乙酸乙酯、甲醇、甲酸、苯、香草醛、浓硫酸、盐酸、三氯甲烷（均为分析纯，购于南宁蓝天实验设备有限公司）；乙腈、甲醇（均为色谱纯，购于南宁市恒鑫生物有限公司）。

1.3 试验药物

3个批次的苦玄参提取物（批号分别为：20170908、20170915、20170922），由广西兽药制剂工程技术研究中心提供。

1.4 试验方法

1.4.1 鉴别法：称量苦玄参浸膏适量，取样量相当于药材 0.5 g，加乙酸乙酯—甲醇（5∶1）混合溶液25 mL，放入具塞锥形瓶中超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液；此外，分别取苦玄参对照药材及ⅠA对照品，加乙醇制成每毫升含1 mg药品的溶液，作为对照药材及对照品溶液。按照参考文献［1］推荐的薄层色谱法试验方法，吸取上述2种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—甲醇（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点。

1.4.2 重复性考察：取3个批次的苦玄参提取物样品，按薄层鉴别标准方法进行检测，考查该方法的重复性。

1.4.3 含量测定

1.4.3.1 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈—水（35∶65）为流动相，检测波长为264 nm，柱温 35℃，流速 1.0 mL/min，检测时间45 min，理论塔板数按ⅠA峰计算应不低于4 000，ⅠA含量不低于 2.5 mg/g。

1.4.3.2 对照品溶液的制备：取ⅠA对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升约含0.1 mg药品的溶液，即得。

1.4.3.3 供试品溶液的制备：称取苦玄参浸膏适量（相当于药材1 g），过3号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.3.4 测定：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，ⅠA含量不得少于2.5 mg/g。

1.4.3.5 专属性试验：分别取ⅠA对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按色谱条件测定，考查方法的专属性。

1.4.3.6 线性考查试验：精密吸取上述对照品溶液 1、3、5、7、9 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，制成不同浓度对照品溶液，精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在色谱条件下测定，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制苦玄参苷标准曲线，求出ⅠA的线性方程，考查ⅠA在规定浓度范围内的线性关系。

1.4.3.7 回收率试验：精密称取已知含量的同一批号苦玄参提取物供试品，称取3份颗粒样品，分别加入3个不同浓度的ⅠA对照品溶液各1 mL，平行3份，再按供试品制备方法处理，按标准的色谱条件测定，记录峰面积，按峰面积计算每份样品的ⅠA含量，分别计算回收率（%）和相对标准偏差RSD（%）。

1.4.3.8 精密度试验

1.4.3.8.1 重复性试验：精密称取同一批号苦玄参提取物供试品，平行6份，按“1.4.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按标准的色谱条件测定，分别记录峰面积，分别根据其峰面积计算相对标准偏差RSD（%）。

1.4.3.8.2 中间精密度试验：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。

1.4.3.9 稳定性试验：取同一批号苦玄参提取物供试品，按“1.4.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别在第 0、4、8、12、16、20、24 h 进样 1 次，每次进样10 μL，测定ⅠA的峰面积，考查其稳定性。

1.4.3.10 样品测定：按色谱条件方法测定3批苦玄参提取物样品的含量，计算ⅠA的含量。

1.5 结果评价

以鉴别试验中的专属性、重复性结果以及含量测定中的专属性、线性、回收率、精密度、稳定性和样品测定结果为评价指标，验证所采用的苦玄参提取物质量标准分析方法的可靠性。

图1 苦玄参提取物中苦玄参鉴别薄层色谱图

2 结果与分析

2.1 鉴别法

经试验证明，利用薄层色谱法鉴别苦玄参是可行的。对3个批次的苦玄参提取物按标准规定的薄层鉴别方法进行检测，结果显示（见图1），在薄层色谱中，3批供试品在与ⅠA对照品及苦玄参对照药材相应的位置上，显现相同颜色的荧光斑点，背景清晰，分离效果好，无干扰，结果易判断，符合薄层色谱系统适用性检验。因此，该项定性鉴别方法对供试品的处理及展开系统的选择是合理的，说明对苦玄参的薄层鉴别已具备专属性，故可作为标准中苦玄参的鉴别方法。

2.2 含量测定

2.2.1 ⅠA含量分析方法的建立

2.2.1.1 波长的选择：取ⅠA对照品，经UV检测器在200～300 nm内进行紫外扫描，结果显示（见图2），ⅠA在260 nm波长附近有最大吸收值。参照参考文献［1］收载的“苦玄参”含量测定项下的波长，选择264 nm为该试验测定波长。

2.2.1.2 系统适应性试验及专属性试验：取苦玄参提取物供试品溶液及对照品溶液，按“1.4.3.1”项下色谱条件分别测定。结果表明（见图3），供试品中ⅠA与相邻峰的分离度良好（均大于1.5）；理论塔板数按ⅠA色谱峰计算，为14 000；阴性样品对测定无干扰，说明方法的专属性良好。

2.2.1.3 线性和范围考察试验：以峰面积积分值y（取平均值）为纵坐标，以对照品浓度x（μg/mL）为横坐标进行回归分析。由表1可知，得到ⅠA的回归方程为：y=7645.5x+18364，R2=0.9992。结果表明，ⅠA在20.06～104.10 μg/mL内线性关系良好。

图2 苦玄参苷光谱扫描曲线图

2.2.1.4 仪器精密度试验

图3 系统适应性试验及方法专属性考察色谱图

2.2.1.4.1 重复性试验：在相同操作条件下，由一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度。取同一份苦玄参提取物样品（批号：20170908），精密称定0.5 g，制备供试品溶液，并依照色谱条件连续进样6次进行测定，计算所含苦玄参苷的含量并统计RSD。由表2可知，样品中ⅠA的平均含量为19.18 mg/g，RSD为0.002%。结果表明，仪器的精密度良好。

2.2.1.4.2 中间精密度试验：在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。取同一份苦玄参提取物样品（批号：20170908），充分研碎，精密称定0.5 g，依照上述方法制得供试品溶液，并依照“1.4.3.1”项下所述色谱条件连续进样6次进行测定，计算所含ⅠA的含量并统计RSD。由表3可知，样品中ⅠA的平均含量为19.20 mg/g，RSD为0.001%。结果表明，仪器的精密度良好。

2.2.1.5 稳定性试验：取同一份苦玄参提取物样品（批号：20170908），精密称定 0.5 g，依照上述方法制得供试品溶液，分别于室温下［温度为（25±2）℃，湿度为（60±10）%］放置 0、4、8、12、16、20、24 h，然后依照“1.4.3.1”项下所述色谱条件测定，计算ⅠA的含量并统计RSD。由表4可知，24 h内苦玄参提取物供试品中ⅠA的平均含量为3.04 mg/g，RSD为0.02%。结果表明，供试品溶液在室温下24 h内稳定。

表1 不同浓度的苦玄参苷对照品的峰面积

表2 ⅠA重复性试验结果（n=6）

表3 ⅠA的中间精密度试验结果（n=6）

表4 ⅠA的稳定性试验结果（24 h）

表5 ⅠA加样回收率试验结果（n=6）

2.2.1.6 方法准确度（加样回收率）试验：取已知含量的苦玄参提取物（批号：20170908），称取约0.1 g，平行6份，分别精密加入已知浓度的对照品溶液适量，配制供试品溶液，然后依照“1.4.3.1”项下所述色谱条件测定。由表5可知，ⅠA的平均回收率为99.90%，RSD为0.53%（n=6）。结果表明，该方法用于苦玄参提取物中ⅠA含量测定的准确度良好。

2.2.1.7 样品测定：取不同批次的苦玄参提取物样品，分别精密称取0.5 g，配制供试品溶液，然后依照 “1.4.3.1”项下所述色谱条件测定，批号20170908、20170915和20170922的样品中ⅠA的含量分别为19.06、19.11、18.99 mg/g。按照3批样品计算，以均值的80%作为含量下限，每批苦玄参提取物中ⅠA含量应不少于15.24 mg/g。

3 讨论

关于苦玄参的薄层色谱鉴定方法，该研究参照《中国药典》（2015 年版 1 部）［1］收载的药材苦玄参的薄层鉴别方法。用该方法进行苦玄参提取物中ⅠA的薄层鉴别，分离效果较好，该法对苦玄参的鉴别符合专属性、重复性及系统适应性试验要求，可作为标准中苦玄参的鉴别方法。

关于苦玄参的HPLC鉴定方法，该研究参照相关文献资料［1，13-18］报道，建立了苦玄参苷ⅠA的含量测定方法。对于提取条件的选择，该研究在ⅠA供试液制备方法考察中，选择了碱提取法（pH值=11），提取3次，提取时间1 h，优选的提取工艺稳定性好，合理可行。该方法对ⅠA对照品的紫外吸收光谱（200～300 nm）测定结果表明，ⅠA在260 nm附近有强吸收。为能灵敏地检出上述成分，选择264 nm作为检测波长。该研究考查了不同比例的乙腈—水流动相系统，结果表明，选择采用乙腈—水（35∶65）作为流动相，具有峰形及分离度良好、出峰时间快等优点。结果显示，供试品在该色谱条件下，ⅠA的峰纯度良好，未与其他峰混杂，专属性好。