应用2周龄ICR小鼠建立CVA16感染模型

王辉强，刘尚裕，李玉环



应用2周龄ICR小鼠建立CVA16感染模型

王辉强，刘尚裕，李玉环

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所病毒室

Enterovirus 71（EV71）和 coxsackievirus A16（CVA16）都属于小核糖核酸病毒科的单正链 RNA 病毒，是引起手足口病的两个主要病原体[1]。临床上，这两种病毒的感染通常是自限性的，小部分感染常与神经系统疾病相关，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎和急性弛缓性麻痹等[2]。手足口病已成为一个严重的公共卫生问题，在日本、马来西亚、新加坡、越南、中国大陆等亚太地区存在周期性的爆发流行[3-5]。目前临床上尚无有效的抗病毒药物用于手足口病的预防和治疗。

抗病毒药物和疫苗的研发依赖于体内外筛选模型的建立，目前国内外CVA16 的动物模型主要是 1 周龄以内的乳鼠模型，但是利用 1 周龄以内的乳鼠进行抗病毒实验操作难度较大，给药途径和给药容量明显受限，而且 1 周龄以内的乳鼠免疫系统发育尚不完善，在进行药物体内药效评价时有一定的局限性[6]。有研究报道，利用干扰素 α/β 和 γ 受体缺陷型小鼠（AG129）适应传代获得的 CVA16 毒株可以感染 12 周龄的 AG129 小鼠，但是该模型缺乏干扰素应答，对于通过调节先天免疫发挥抗 CVA16 作用的药物无法评价其体内药效，并且相对于常用的 ICR 等小鼠，AG129 小鼠的实验成本会增加[7]。本实验室通过将 CVA16 的临床分离株在 ICR 乳鼠上的逐渐适应传代成功建立了 2 周龄 ICR 小鼠的感染模型，采用细胞病变（CPE）法测定感染小鼠心、脾、肺、肾、小肠、脑和肌肉组织的 CVA16 病毒滴度，并利用 Western blot 方法检测各组织中 CVA16 蛋白的表达。另外，利用该模型初步评价抗病毒药物利巴韦林（RBV）的体内抗 CVA16 的药效。该模型的建立可以更好地服务于抗 CVA16 药物和疫苗的研发，也可进行 CVA16 发病机制的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 孕龄 17 ~ 18 d 的 ICR 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2012-0001]，待小鼠分娩后记录乳鼠日龄，根据国家科学委员会设立的指导方针，按实验动物使用的 3R 原则给予人道的关怀。

1.1.2 细胞和病毒 Vero 细胞为本室自行传代保存。CVA16（shzh05-1/GD/CHN/2005）由中国疾病预防控制中心提供，于 Vero 细胞中传代，–80 ℃冰箱保存。细胞培养所用 MEM 培养基、胎牛血清及 PBS 均购自美国 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒接种与传代实验方法 将 100 μl 的 CVA16 原液（大约 1 × 104TCID50）腹腔注射于 1 日龄 ICR 小鼠体内，9 d 后取后肢肌肉，经研磨得到组织研磨液后感染 Vero 细胞，待 90% 以上细胞出现细胞病变时收集病毒，于–80 ℃反复冻融 3 次后离心得到 CVA16-MA-I 毒种。将 CVA16-MA-I 毒种原液 100 μl 腹腔注射感染 6 日龄 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，经研磨得到组织研磨液后感染 Vero 细胞，收集得到 CVA16-MA-II 毒种。再将 CVA16-MA-II 毒种原液 100 μl 感染 12 日龄 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，经研磨得到组织研磨液后感染 Vero 细胞，收集得到 CVA16-MA-III 毒种。12 日龄 ICR 小鼠腹腔注射感染 CVA16-MA-III 毒种原液 100 μl，7 d 后取后肢肌肉，经研磨得到组织研磨液后感染 Vero 细胞，收集得到 CVA16-MA-IV 毒种。利用 CVA16-MA-IV 毒种原液 100 μl 感染 2 周龄 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，经研磨得到组织研磨液后感染 Vero 细胞，收集得到 CVA16-MA-V毒种。

1.2.2 适应毒株 CVA16-MA-V 的 LD50测定 将 CVA16-MA-V 毒种以1 × 100、1 × 10-1、1 × 10-2、1 × 10-34 个稀释度腹腔注射感染 2 周龄 ICR 小鼠，100 μl/只，观察小鼠死亡情况，记录死亡数并计算出 CVA16 对 2 周龄 ICR 小鼠的 LD50感染量，并作为后续实验感染量的基础。

1.2.3 小鼠组织中 CVA16 病毒滴度和病毒蛋白测定 将 CVA16-MA-V 毒种采用腹腔注射方式感染 2 周龄 ICR 小鼠（10 LD50），7 d 后采集小鼠心、脾、肺、肾、小肠、脑和肌肉组织，每种组织分两份并称重。将其中一份组织研磨得到的研磨液稀释后，感染 Vero 细胞（细胞数 3 ×104/孔）进行病毒滴度测定，在 72 h 后观察 CPE 并计算 TCID50。另一份组织采用动物组织蛋白提取试剂提取蛋白，采用 BCA 定量后进行 Western blot 检测。一抗 CVA16 和 β-actin 均 4 ℃孵育过夜。

1.2.4 利巴韦林体内药效评价 将 CVA16-MA-V 毒种10 LD50采用腹腔注射方式感染 2 周龄 ICR 小鼠（15 只），感染 1 h 后，用 50 mg/kg 的利巴韦林进行腹腔注射给药，正常对照组和病毒对照组腹腔注射等量的生理盐水，每天给药 1 次，共 7 d。每组随机选取 5 只小鼠，在末次给药后采集后肢肌肉组织，进行病毒滴度测定和病毒蛋白检测。另外 10 只小鼠观察发病及死亡情况，共观察 14 d。

1.2.5 病变（毒力）判定标准 根据临床表现划分 5 个等级：4 代表死亡；3 代表后肢瘫痪或垂死；2 代表后肢无力；1 代表毛发上竖散乱；0 代表正常。

1.3 统计学处理

采用 SPSS13.0 统计程序的卡方检验法比较存活率，并用 Kaplan-Meier 法比较平均生存时间。

2 结果

2.1 建立 2 周龄 CVA16 感染致死的 ICR 小鼠模型

首先，我们对适应传代获得的 CVA16-MA-V 毒种进行 LD50的测定，图 1 结果显示，不同稀释度的 CVA16-MA-V毒种采用腹腔注射方式感染 2 周龄 ICR 小鼠后，1 × 100、1 × 10-1、1 × 10-2稀释度的感染量小鼠全部死亡，而 1 × 10-3稀释度的小鼠一半发生死亡，CVA16-MA-V 毒种的 LD50为 1 × 10-3稀释度，经 Vero 细胞上病毒滴度检测，CVA16-MA-V 毒种的 LD50约为 10 TCID50。

用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周龄的 ICR 小鼠，小鼠感染后逐渐出现毛发散乱、后肢无力、后肢瘫痪的症状。后肢麻痹无力在发病初期是发展较为缓慢的，在死亡前 1 ~ 2 d 后肢麻痹无力发展为后肢瘫痪。在整个感染过程中，小鼠的体重发生显著的下降（图 2A）。另外，原 CVA16 毒株不能有效感染 1 周龄以上的小鼠，对于 1 周龄以下的小鼠可以感染，但是不会出现死亡。CVA16-MA-V 毒株可以对 2 周龄以内的小鼠造成感染死亡，但是 3 周龄及以上的 ICR 小鼠腹腔注射 CVA16-MA-V 后没有观察到发病症状和死亡。

图 1 CVA16-MA-V 感染 ICR 小鼠的剂量依赖性

2.2 CVA16-MA-V 在感染 ICR 小鼠中的组织分布

采用腹腔注射方式，用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周龄的 ICR 小鼠，在感染后 7 d，采集小鼠的心脏、脾脏、肺、肾、脑、肠以及后肢肌肉组织。将各组织研磨后的组织研磨液感染 Vero 细胞，采用 CPE 的方法检测发现，在心脏、脾脏、肾脏、肠道和肌肉中均可检测到病毒（图 3A），且后肢肌肉中病毒载量最高。然而，在肺和大脑中没有检测到病毒。另外，用 Western blot 方法对各组织蛋白进行分析。结果如图 3B 所示，在心脏、脾脏、肾脏、肠和肌肉中也检测到 CVA16 蛋白表达，但在肺和大脑中均未检测到病毒蛋白。

图 2 利巴韦林对CVA16-MA-V 感染小鼠的抗病毒作用（A：小鼠感染9 d 内的体重；B：Western blot 检测小鼠肌肉中CVA16 的蛋白表达；C：小鼠组织的病毒滴度；D：小鼠感染14 d 的存活率；与病毒对照组比较，**P < 0.05）

图 3 CVA16 感染后 7 d 小鼠组织中的病毒载量（A：CPE 法；B：Western blot 法）

表 1 利巴韦林治疗对 CVA16-MA-V 感染小鼠的体重（g）影响

时间（d）正常对照组病毒对照组利巴韦林组 27.38 ± 0.477.45 ± 0.377.04 ± 0.48 48.35 ± 0.368.08 ± 0.428.13 ± 0.42 68.89 ± 0.507.59 ± 0.39**8.37 ± 0.78# 810.92 ± 0.976.34 ± 0.42**8.03 ± 0.89#

注：n = 10；与正常对照组比较，**< 0.01；与病毒对照组比较，#< 0.05。

表 2 利巴韦林治疗对 CVA16-MA-V 感染小鼠死亡比例和平均存活时间的影响

注：n = 10；与正常对照组比较，**< 0.01；与病毒对照组比较，##< 0.01。

图 4 利巴韦林治疗延缓 CVA16-MA-V 感染小鼠的发病过程（A：正常小鼠的临床评分；B：病毒对照组感染小鼠的临床评分；C：利巴韦林治疗组小鼠的临床评分）

2.3 利巴韦林抑制 CVA16 的体内复制，延缓发病过程

建立 2 周龄的 CVA16 感染模型后，我们进一步研究该模型的体内药效评价适应性，明确该模型是否适合于抗 CVA16 的药物体内药效评价及机制研究。采用腹腔注射方式，用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周龄的 ICR 小鼠，利巴韦林治疗组腹腔注射给药 50 mg/kg，每天 1 次，连续 7 d。结果显示，治疗 7 d 的受感染小鼠肌肉组织中的 CVA16 病毒蛋白含量明显减少（图 2B）。此外，50 mg/kg 利巴韦林明显降低感染小鼠后肢肌肉中的 CVA16 病毒滴度（图 2C）。同时，我们也观察到 50 mg/kg 的利巴韦林治疗后，小鼠的体重减轻得到延缓（表1 和图 2A），并增加了受感染小鼠的存活率（图 2D）。病毒对照组小鼠的平均生存时间（MST）为（7.6 ± 1.1）d，而利巴韦林治疗组的小鼠平均生存时间为（10.8 ± 2.8）d（表2），利巴韦林明显延长小鼠的存活时间。图 4 所示，病毒对照组小鼠出现毛发散乱、后肢无力、后肢瘫痪，8 d 内全部死亡，而利巴韦林可以延缓感染小鼠的发病过程，起到保护小鼠的作用。

3 讨论

EV71 和 CVA16 是引起 5 岁以下儿童手足口病的两大主要病原体，而手足口病的爆发严重影响了社会稳定。然而，目前尚无有效的药物用于预防或治疗手足口病[8]。缺乏合适的动物模型阻碍了抗手足口病药物的研发。目前国内外已经有许多实验室建立了 EV71 感染的不同模型，包括免疫缺陷小鼠和转基因小鼠等，并用于候选药物的体内药效评价[9-12]。

在之前的研究中，我们使用 2 周龄的 BALB/c 小鼠建立了 EV71 感染的动物模型，并利用该模型评价了许多候选化合物的体内抗 EV71 的药效[13]。此次我们通过逐代适应的方法，获得可以感染 2 周龄 ICR 小鼠的 CVA16 适应株 CVA16-MA-V。CVA16-MA-V 感染 2 周龄的 ICR 小鼠可以引起肢体无力乃至瘫痪的症状，并且在众多组织器官中均可以检测到病毒，其中以肌肉中的病毒载量最高。利用该模型评价临床用抗病毒药物利巴韦林的体内抗 CVA16 药效，结果显示 50 mg/kg 的利巴韦林即可显著减少小鼠肌肉中 CVA16 的病毒滴度和病毒蛋白表达，又提高了感染小鼠的存活率和平均存活时间。我们会在后续的研究工作中进一步开展 HE 染色或免疫组化等方法检测药物的体内药效等研究，不断完善该模型的体内药效评价方法。综上所述，我们建立的 2 周龄 ICR 小鼠的 CVA16 感染模型对现有的 CVA16动物模型是个很好的补充，可以促进我国抗 CVA16 药物的研发及 CVA16 发病机制的研究。

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国家自然科学基金（81503118）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（CAMS-I2M-1-010）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2018ZX09711003-005-004）

李玉环，Email：yuhuanlibj@126.com

2018-01-25

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.013