高通量测序技术分析浓香型白酒中温曲和高温曲的细菌群落结构

刘延波，赵志军，陈黄曌，孙西玉,2，潘春梅

（1.河南牧业经济学院生物工程学院，河南郑州 450046）（2.张弓老酒酒业有限公司，河南宁陵 476733）

浓香型白酒以其“窖香浓郁、绵柔甘洌、香味协调”的酒体风格在我国白酒行业中占据主导地位[1]。大曲作为酿酒的动力在浓香型白酒的酿造中起着举足轻重的作用，自古就有“酒之骨”之称。大曲的质量对酒的质量和出酒率都有极大的影响[2]。由于大曲采用生料制曲、自然接种，即原料没有经过灭菌，而且菌种还可来自制曲环境中的空气和工具，涉及的微生物种类和数量都极为复杂。因此也是酿酒微生物研究的重要内容[3,4]。而大曲中细菌的构成及其衍变情况对形成浓香型白酒的酒体风格具有重要影响[5]。

传统分离培养单个微生物的方法只能对大曲中极少数能分离的菌种进行研究[6,7]，存在很大的局限，无法全面揭示大曲微生物的结构特征。早期研究获得微生物遗传信息多样性的方法主要包括末端限制性片段长度多态性分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、16S rDNA克隆文库分析和荧光原位杂交[8]，以上方法主要基于传统Sanger测序技术来开展，测序通量有限且只能检测环境中部分高丰度菌株的微生物信息，无法一次性全面获得整个环境中微生物的多样性及功能基因信息。也不能对样品中微生物群落进行较为完备的测序研究，同时工作量大、灵敏度不高。高通量测序技术对微生物群落结构的研究有其明显的先进性和优势，准确定量、读长长、实时检测等[9,10]。可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构，是分析复杂多菌种样品的首选方法[11,12]。目前，高通量测序技术已经运用于分子生物学领域[13]和土壤微生物群落研究[14,15]。但目前应用高通量测序技术对浓香型白酒酿造微生物的研究报道较少，仅有陈玲等[16]以浓香型白酒大曲为研究对象，基于16S rRNA基因为目的片段，分别采用微生物指纹图谱分析技术16S rDNA克隆文库法和高通量测序法分析了大曲中细菌微生物群落的组成。浓香型白酒大曲分中温曲和高温曲，针对单一品种大曲的细菌群落信息研究报道很多[17,18]，较全面地分析中温和高温大曲中细菌群落结构的研究却未见报道。

本试验运用高通量测序技术，利用Illumina公司Miseq测序平台对浓香型大曲白酒酿造中的中温曲和高温曲进行研究，分析浓香型大曲白酒酿造过程中主要细菌构成，建立一套高通量测序技术分析浓香型白酒大曲细菌的方法，同时通过数据分析，完整的解析浓香型白酒大曲中细菌的群落结构。为建立浓香型白酒大曲微生物信息数据库，优化大曲发酵工艺和提升品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验用的大曲材料是贮存5个月的浓香型白酒大曲，由张弓老酒酒业有限公司提供。分为中温曲和高温曲两种。分别粉碎后于迅速置于冰盒运回，-20 ℃保藏备用[19]。

1.2 试验试剂与仪器

E.Z.N.A.Soil DNA Kit购自 OMEGA Bio-tek Inc.；Qubit2.0 DNA检测试剂盒购于 Life Technologies Corporation；Taq DNA Polymerase购于Thermo Fisher Scientific；Agencourt AMPure XP购于 Beckman coulter。

台式离心机，Thermo Fisher；漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；混匀型干式恒温器，深圳拓能达科技有限公司；电泳槽和电泳仪电源，北京市六一仪器厂；凝胶成像系统，美国UVP；Qubit®2.0荧光计，Invitrogen；PCR仪，BIO-RAD；移液器，Eppendorf；高通量测序平台，Illumina公司 Miseq 2×300 bp测序平台。

1.3 基因组DNA提取

分别取中温曲和高温曲粉碎混匀后的样品，每个样品 0.2～0.3 g，参照 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取大曲中微生物总宏基因组，琼脂糖电泳检测DNA总量和完整性，-20 ℃保存。

1.4 PCR扩增

第一轮扩增，利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对基因组 DNA精确定量，以确定 PCR反应应加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的 V3-V4通用引物[20]。341F引物：CCCTACAC GACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGG CWGCAG 805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGC ACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATC C产物长度约460 bp。PCR反应体系为50 μL。体系包括：5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTP(10 mM each)，10 ng Genomic DNA，0.5 μL Bar-PCR primer F(50 μM)，0.5 μL Primer R (50 μM)，0.5 μL Plantium Taq(5 U/μL)加ddH2O 到50 μL。PCR 反应程序为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；45 ℃，20 s；65 ℃，30 s，5 cycles；94 ℃，20 s；55 ℃，20 s；72 ℃，30 s，20 cycles；72 ℃延伸5 min。PCR结束后进行第二轮扩增。

第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物。PCR 反应体系为 50 μL。体系包括：5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTP(10 mM each)，20 ng DNA，0.5 μL primer F(50 μM)，0.5 μL Primer R (50 μM)，0.5 μL Plantium Taq(5 U/μL)加 ddH2O 到 50 μL。PCR 反应程序为：95 ℃，30 s；95 ℃，15 s；55 ℃，15 s；72 ℃，30 s，5 cycles；72 ℃延伸5 min。PCR结束后，产物进行琼脂糖电泳检测，凝胶成像观察，扩增效果较好（图1）。

图1 中温曲和高温曲的PCR产物鉴定Fig.1 PCR product identification of medium temperature Daqu and high temperature Daqu

1.5 DNA纯化回收

参照Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒说明书回收纯化目的条带。

1.6 定量混合和高通量测序

利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1:1的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol[21,22]。委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用Illumin公司Miseq 2×300 bp测序平台进行高通量测序[23]。

2 结果与讨论

2.1 测序数据的合理性分析

对中温曲和高温曲样品采用试剂盒提取基因组DNA后，对18S V3-V4区进行高通量测序，细菌引物设计长度为460 bp左右，测序平均长度462 bp，可以看出序列平均长度和序列总数显示测序结果较好。由于 Hiseq双端测序原始序列 3’端可能带有 adaptor接头序列，以及一些少量低质量序列和杂质序列，为了提高后续分析质量和可靠性，对原始序列进行去接头、质量剪切等处理。质控后的序列长度为去除barcode、两端primer、以及部分低质量序列的统计结果。中温曲有41989个序列，平均长度421 bp，高温曲有44762个序列，平均长度419 bp，再通过去除嵌合体与靶区域外序列发现，中温曲有41333个序列，高温曲有43287个序列(表1)。

表1 中温曲和高温曲基本测序数据Table 1 Basic sequencing data of medium temperature Daqu and high temperature Daqu

2.2 细菌OTU (Operational Taxonomic Units)分类

根据97%水平下OTU的丰度，对测序产生的标签序通过聚类分析划分操作单元，其中中温曲有2026个OTU序列，高温曲有2961个(表2)。

2.3α多样性分析

α多样性分析是用来表征某个特殊区域或者生境中的物种多样性[24]，通常用shannon指数，chao值以及 simpson值来衡量微生物物种的多样性。其中，shannon指数值越高，物种多样性越丰富，simpson值越高，物种多样性越少。其中高温曲的shannon指数3.807674比中温曲的 2.827305高，而 simpson值0.081072比0.181327低，所以高温曲样本中的微生物多样性与中温曲不同，复杂度明显比中温曲高。两种大曲的样本覆盖率均高于94%，因此均能较客观地反映大曲样本中细菌微生物菌群结构的真实信息(表2)。

表2 中温曲和高温曲的细菌多样性指数Table 2 Bacterial diversity index of medium temperature Daqu and high temperature Daqu

2.4 大曲细菌门科分类

通过软件分析以丰度＞0.01%为阈值，中温曲共得到7个门。高温曲15个门。以丰度＞0.5为阈值，中温曲共得到3个门，分别是：是Firmicutes(厚壁菌门，35823,86.67%)，其次为Proteobacteria(变形菌门，4511,10.91%)，Cyanobacteria/Chloroplast(蓝藻菌门，779,1.88%)。

图2 中温曲和高温曲细菌门科分类Fig.2 Classification of medium temperature Daqu and high temperature Daqu

高温曲共得到 6个门，分别是：Firmicutes(厚壁菌门，33400,77.16%)，Proteobacteria(变形菌门，5430,12.54%)，Actinobacteria(放线菌门，1677,3.87%)，Cyanobacteria/Chloroplast(蓝藻菌门，901,2.08%)，Bacteroidetes(拟杆菌门，523,1.21%)，Deinococcus-Thermus(异常球菌-栖热菌门，508,1.17%)(图2)。

图3 中温曲和高温曲的细菌群落结构Fig.3 Bacterial community structure of medium temperature Daqu and high temperature Daqu

以丰度＞0.01%为阈值，中温曲共得到19个属，高温曲26个属。以丰度＞0.5为阈值，中温曲共得到12个属，分别是Kroppenstedtia(45.11%)，Lactobacillus(乳杆菌属，26.36%)，Acetobacter(醋酸单胞菌属，7.45%)，Thermoactinomyces(高温放线菌属，5.43%)，Bacillus(芽孢杆菌属，2.56%)，Weissella(魏斯氏菌属，2.2%)，Streptophyta(1.88%)，Pediococcus(小球菌属，1.61%)，unclassified(1.47%)，Pantoea(泛菌属，1.46%)，Staphylococcus(葡萄球菌属，0.88%)，Oceanobacillus(海洋杆菌属，0.58%)，Melghirimyces(0.5%)。高温曲有15个属分别是Bacillus(芽孢杆菌属，20.93%)，Lactobacillus(乳杆菌属，18%)，Staphylococcus(葡萄球菌属，12.33%)，Thermoactinomyces(高温放线菌属，12.29%)，Acetobacter(醋酸单胞菌属，7.69%)，Kroppenstedtia(6.9%)，unclassified(2.55%)，Streptophyta(1.96%)，Brevibacterium(短杆菌属，1.63%)，Weissella(1.22%)，Thermus(栖热菌属，1.17%)，Saccharopolyspora(0.9%)，Citrobacter(柠檬酸杆菌属，0.87%)，Streptococcus(链球菌，0.83%)，Brevundimonas(短波单胞菌属，0.67%)，Allobacillus(0.6%)(图 3)。

3 结论

3.1 本实验通过高通量测序法分析了浓香型大曲中细菌的群落结构。发现中温曲中细菌主要分布于Firmicutes(厚壁菌门，86.67%)，Proteobacteria(变形菌门，10.91%)，Cyanobacteria/Chloroplast(蓝藻菌门，1.88%)。高温曲中主要分布于Firmicutes(厚壁菌门，77.16%)，Proteobacteria(变形菌门，12.54%)，Actinobacteria(放线菌门，3.87%)，Cyanobacteria/Chloroplast(蓝藻菌门，2.08%)，Bacteroidetes(拟杆菌门，523,1.21%)，Deinococcus-Thermus(异常球菌-栖热菌门，1.17%)，陈玲等(2015)研究发现大曲中的微生物主要分布于Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Cyanobacteria/Chloroplast(蓝藻菌门)4个菌门[16]。本文研究结果与和陈玲的基本一致。Bacteroidetes(拟杆菌门)被王明跃等(2014)发现在窖泥细菌中为优势分类门[25]。

3.2 在属的分类水平上分析，优势类群(丰度＞1%)中温曲有10个类群，分别是Kroppenstedtia(45.11%)，Lactobacillus(乳杆菌属，26.36%)，Acetobacter(醋酸单胞菌属，7.45%)，Thermoactinomyces(高温放线菌属，5.43%)，Bacillus(芽孢杆菌属，2.56%)，Weissella(魏斯氏菌属，2.2%)，Streptophyta(1.88%)，Pediococcus(小球菌属，1.61%)，unclassified(未分类细菌，1.47%)，Pantoea(泛菌属，1.46%)。高温曲有 11个类群：Bacillus(芽孢杆菌属，20.93%)，Lactobacillus(乳杆菌属，18%)，Staphylococcus(葡萄球菌属，12.33%)，Thermoactinomyces(高温放线菌属，12.29%)，Acetobacter(醋酸单胞菌属，7.69%)，Kroppenstedtia(6.9%)，unclassified(未分类细菌，2.55%)，Streptophyta(1.96%)，Brevibacterium(短杆菌属，1.63%)，Weissella(魏斯氏菌属，1.22%)，Thermus(栖热菌属，1.17%)。孟镇等(2010)和张明春等(2010)研究得出大曲中的优势类群为Lactobacillaceae(乳杆菌科)[26,27]；高亦豹等(2010)用PCR-DGGE未培养技术对中国白酒高温和中温大曲细菌群落结构的分析发现Lactobacillaceae(乳杆菌科)、Staphylococcus(葡萄球菌属)、Klebsiella(克雷伯属)、Thermoactinomyces(高温放线菌属)和Weissella(魏斯氏菌属)普遍存在于不同工艺大曲中[28]；汤斌等(2011)通过构建16S rDNA克隆文库，得出大曲中细菌微生物主要为Lactobacillaceae(乳杆菌科)和Bacillus(芽孢杆菌属)[29]；明红梅等(2013)采用传统培养方法得出浓香型大曲中的细菌优势类群分别为Bacillus(芽孢杆菌属)、Pseudomonas(假单胞菌)、Lactobacillaceae(乳杆菌科)以及Acetobacer(醋酸单胞菌属)[30]；陈玲等(2015)研究发现在属的分类水平下，Bacillus(芽孢杆菌属)、Lactobacillaceae(乳杆菌科)、Pseudomonas(假单胞菌)、Streptomyces(链霉菌属)为大曲中的主要类群[16]。Oceanobacillus(海洋杆菌属)是熊小毛等(2014)通过PCR-DGGE分析典型的浓酱兼香型白酒白云边酒大曲时发现的[31]；Pediococcus(小球菌属)，Pantoea(泛菌属)，Streptophyta和Brevibacterium(短杆菌属)是李德林等(2014)采用PCR-DGGE方法研究浓香型白酒糟醅微生物群落结构中发现的[32]。

以上研究报道与本次高通量测序结果相似，相对其它研究方法高通量测序发现了更多的细菌类群。本文首次从浓香型白酒中温曲中检测出的类群有Pediococcus(小球菌属)，Pantoea(泛菌属)，Melghirimyces。从高温曲中检测出的类群有Streptophyta，Brevibacterium(短杆菌属)，Thermus(栖热菌属)，Saccharopolyspora，Citrobacter(柠檬酸杆菌属)，Streptococcus(链球菌)，Brevundimonas(短波单胞菌属)，Allobacillus。

3.3 大曲中的主要细菌Bacillus(芽孢杆菌属)具有耐盐、耐酸和耐高温等特点，能够产生各种代谢产物和酶，代谢产物和酶进一步发生酯化生化反应，生成白酒的呈香呈味物质，形成白酒的有效质量成分[33]。Lactobacillus(乳杆菌属)是白酒生产中非常重要的微生物之一，在酿造过程中具有促进美拉德反应、促进酿酒的发酵、维护与保持酿酒微生态环境等作用[34]。Thermoactinomyces(高温放线菌属)具有典型放线菌形态，系统进化却更接近于芽胞杆菌，具有较强的耐高温能力[35]。Kroppenstedtia是姚粟等(2012年)利用通过构建16S rDNA克隆文库非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲细菌群落多样性发现的优势属[36]。此外研究还发现高温曲中的细菌较中温曲的细菌相比Bacillus(芽孢杆菌属)和Thermoactinomyces(高温放线菌属)显著上升，而Kroppenstedtia和Lactobacillus(乳杆菌属)显著下降，原因可能是张弓酒独特的制曲工艺有关，其在制曲温度上中温大曲采用中温偏高的培曲温度，高温大曲制曲工艺采取麦草堆盖和较高的制曲温度[37]。高温曲以高温培菌，在细菌菌群构成上以高温嗜热菌为主。中温曲以中温培菌，因此菌群则以常温菌为主，两类大曲菌群不同的代谢特征对白酒风味形成将产生不同影响，表现出白酒的特有风格。

3.4 本研究发现高通量测序技术可以应用于微生物群落的物种分类研究，其具有操作简单、通量较高和信息丰富等优点，在分析大曲细菌群落的研究中具有一定的优越性。利用该研究成果可以进一步在酒曲中选育与酒曲性能相关的功能菌株，为深入研究浓香型白酒大曲微生物，优化大曲工艺及提高酒曲质量指明了方向，具有重要的理论和实践意义。

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