高效液相色谱法测定黑曲霉xj菌丝体中糠醛的含量

2018-06-08吉玉玉

中国酿造 2018年5期

张素，肖洋，吉玉玉，邱勇，黄婕，李祝*

（1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州毕节 551700；3.贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550003）

糠醛（furfural）又称2-呋喃甲醛，是呋喃环系最重要的衍生物。在1832年被发现，最初是通过米糠（furfur）与稀酸共热来获得的，所以叫糠醛[1]。糠醛分子式为C5H4O2，是羰基化合物的一种，化学性质活泼。以糠醛为原料能直接或间接衍生如糠醇、糠酸、呋喃、四氢糠醇等物质，还可通过与甲醛的羟甲基化作用生成5-羟甲基糠醛。工业生产方法都是用木材或农林副产品等在催化剂的作用下通过水解，将戊聚糖转化为戊糖，戊糖再经脱水环化生成糠醛的方法进行生产的[2]。目前糠醛制备主要集中在黑曲霉联合水解花生壳、玉米芯之类[3-5]，但没有黑曲霉独立产糠醛的相关报道。对于糠醛的分析方法主要有肟化法、四溴化法、比色法[6]、电位滴定法[7]等，但这些方法测定操作复杂，易产生干扰且准确度不高。用高效液相色谱法测定油中糠醛含量已有报道[8-9]，但对于测定微生物菌丝体中糠醛含量的研究并不多。高效液相色谱法是近几年兴起的一门技术，具有检测速度快、分析效率高、灵敏度高等特点，在食品检测中得到了广泛应用[10-11]。采用高效液相色谱法分析，确定该菌株发酵能够产生糠醛，且具有简便、快速、准确度高等优点。因此使用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定黑曲霉菌丝体中糠醛含量，可为今后探索黑曲霉菌丝体中存在物质提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉（Aspergillus niger）xj（保藏号：M206021）：中国典型培养物保藏中心；糠醛标准品（纯度99.9%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙醚、无水乙醇、冰乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；本实验所用水为超纯水；马铃薯葡萄糖琼脂potato dextrose agar，PDA）培养基为实验用普通培养基。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪（含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器（diode-arraydetector，DAD）、Agilent色谱工作站）：美国Agilent公司；FA2204N电子分析天平：上海向帆仪器有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：SpheriorbC18（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸调）=10∶90（V/V）；流速：1.0mL/min；检测波长：277 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μL。

1.3.2 菌丝体的制备

将黑曲霉xj菌株接于PDA固体斜面培养基上，27℃静置培养3～5 d，活化2～3次，于4℃保存备用；将活化好的菌株，制成均一孢子悬液；将孢子悬液以8%～12%（V/V）接种量接种于装有PDA液体种子培养基的10 L发酵罐中，26～28℃、100～120r/min、通气量控制在500～700L/h的条件下小罐培养2～3 d，得种子液；取种子液以10%～15%V/V）接种量接种于装有PDA发酵培养基的80 L发酵罐中，26～28℃、搅拌速度80 r/min、通气量控制在2.5 m3/h的条件下大罐培养3～5d终止发酵，4层无菌纱布过滤除去发酵液，收集菌丝体。

1.3.3 菌丝体的提取

将干燥菌丝体研磨成粉末，称取10 g菌丝体于150 mL沸水抽提8 h，纱布过滤后8 000 r/min离心20 min。取上清液加入150 mL乙醚萃取（重复两次，合并萃取液得200 mL），将所得萃取液常温挥干，以甲醇溶解定容至5mL，过0.45μm滤膜[12]，上机待测。

1.3.4 糠醛标准曲线的绘制

标准储备液的配制：准确称取糠醛标准品1mg，用1mL甲醇溶解，所得质量浓度为1 mg/mL。将标准储备液稀释成质量浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准溶液，按照上述条件进行测定。以质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标作图绘制糠醛HPLC标准曲线。

2 结果与分析

2.1 检测条件的确定

采用Spheriorb C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸调）=10∶90（V/V）为流动相，流速1.0 mL/min，波长为277 nm。实验选择乙腈作为有机流动相，分离效果清晰，杂质峰干扰小。在此色谱条件下，糠醛呈现较好的分离效果和重现性。

2.2 标准曲线及线性关系的考察

以质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标作图得糠醛HPLC标准曲线，结果见图1。由图1可知，糠醛线性回归方程为y=60.851x+73.745（R2=0.999），线性范围在糠醛质量浓度1～50 μg/mL之间呈良好的线性关系，满足样品测试要求。

图1 糠醛HPLC标准曲线Fig.1 HPLC standard curve of furfaral

2.3 仪器精密度的考察

精密吸取20 μg/mL的糠醛对照品溶液10 μL，按上述测定条件连续进样8次，精密度实验结果见表1。由表1可知，糠醛测定结果的相对标准偏差（relative standaral deviation，RSD）为0.77%，精密度满足方法学定量要求。

表1 精密度实验结果Table 1 Results of precision experiments

2.4 重复性实验

精密称取同一批次菌丝体样品各6份，照上述供试溶液的制备方法和测定条件，制备6份供试溶液并测定，重复性实验结果见表2。由表2可知，对同一批次样品多次取样分析，RSD为0.98%，表明该方法具有良好的重现性。

表2 重复性实验结果Table 2 Results of repeatability experiments

2.5 加标回收率实验

向糠醛标准品溶液中添加黑曲霉菌丝体9份，分为低、中、高3种浓度水平（各浓度平行3次）。按照样品处理方法处理样品并测定，计算回收率，结果见表3。结果（表3）表明，样品回收率均在90.51%～93.54%，RSD为1.9%，误差在允许范围之内。

表3 回收率实验结果Table 3 Results of recovery rate experiments

2.6 样品测定

糠醛标准品及黑曲霉菌丝体样品中糠醛含量测定高效液相色谱图见图2，其中糠醛的保留时间为5.482 min，经计算黑曲霉菌丝体中糠醛的含量为1.872 mg/kg。

图2 糠醛标准品（A）及黑曲霉菌丝体样品糠醛含量（B）测定高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of furfural standard(A)and furfural in Agergillus nigermyceium sample(B)

3 结论

本实验采用乙醚萃取，通过高效液相色谱法测定黑曲霉菌丝体中糠醛的含量为1.872 mg/kg。测定条件：采用Spheriorb C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸调）（体积比10∶90），柱温30℃；流速1.0 mL/min，波长λ=277nm，进样体积为10 μL。保留时间为5.482 min，最低检出浓度为0.01 mg/kg，回收率为90.51%～93.54%，精密度试验结果RSD为0.98%。

国内使用液相色谱法检测糠醛对象主要集中在乳制品、酒类、酱油等，尚无关于检测黑曲霉菌丝体中糠醛的报道。本文建立了检测黑曲霉菌丝体中糠醛含量的分析方法，该方法具有灵敏度高、重现性好、杂质少等特点，为今后黑曲霉菌丝体中糠醛含量的测定提供有效的分析方法和有意义的参考数据。

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