鱼露中耐盐菌的分离鉴定及发酵性能比较

伍蓉莉，欧阳信，段 杉*，段星星，翟苗苗，张林静，凌晓怡，高向阳

（华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642）

鱼露一般以鱼、虾等为原料，是在多种微生物共同参与下酿制而成的一种调味品[1]。鱼露的发酵涉及多种微生物的作用，研究表明酵母菌和乳酸菌对其风味有较大影响[2]，耐盐乳酸菌是其中的优势菌[3]。嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）属于乳酸菌，革兰阳氏性球菌，四联或成对，常存在于高盐发酵食品中[4-5]，能在盐浓度高达25%的条件下生长[6]。中国传统露天酿造的酱油中存在嗜盐四联球菌，其发酵得到的酱油的安全性被广大群众接受。并且研究表明，将嗜盐四联球菌与蛋白酶结合，能提高产品风味[7-8]。赵国忠等[9]在酱油酿造过程中添加耐盐乳酸菌，提高了产品的品质。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）属乳酸菌之一，产L-乳酸[10]，尽管其安全性尚不明确，但由于它也是从鱼露中分离出来的，并且目前不清楚它对鱼露风味有何贡献，所以本文暂时将其与嗜盐四联球菌一起进行比较研究。

目前对鱼露的研究集中在发酵工艺[11]、微生物动态分析[12]、耐盐机制[13]，但是鱼露中不同种的耐盐乳酸菌发酵特性如何？同一种但不同株的耐盐乳酸菌的发酵特性是否存在差异？这些问题尚不明确，有待进一步研究探讨。故本研究从鱼露中筛选耐盐乳酸菌，并进一步比较不同耐盐乳酸菌的发酵特性，旨在为今后将耐盐乳酸菌应用于鱼露的发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

鱼露：发酵中期的鱼露，广东省汕头鱼露厂有限公司提供；蓝圆鲹（Decapterus maruadsi），又名巴浪鱼：广州市天河区长湴综合市场。

1.1.2化学试剂

牛胰蛋白酶（250 U/mg）：广州市天河区；酶制剂：上海源聚生物科技有限公司；复合蛋白酶（120 U/mg）：广州市天河区；酶制剂：广州市天河区远天酶制剂厂；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：美国Zymo Research公司；引物：上海生工生物工程技术服务有限公司；组胺标准品、5′-肌苷酸二钠（5′-inosinic acid disodium salt hydrate，IMP）标准品、5′-鸟苷酸二钠（5′-guanylicaciddisodium salthydrate，GMP）：美国Sigma公司。

1.1.3 培养基

乳酸细菌（MRS）培养基：广东环凯生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T196DNA聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增仪：德国BIOMETRA公司；LC-10AT高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）仪（配SPD-10A紫外检测器）：日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的筛选

以发酵中期的鱼露为原料，用20%的盐水将鱼露样品稀释成不同的梯度后分别涂布于用含10%NaCl、0.2%碳酸钙的MRS培养基上进行筛选。于30℃有氧培养5 d。挑取产生溶钙圈的菌落经2～3次分离纯化得到单菌落。

1.3.2 菌株的鉴定

形态学鉴定：将得到的单菌落进行革兰氏染色并进行形态学观察。

分子生物学鉴定：提取G+细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），利用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增其16SrDNA序列。PCR扩增体系：Taq酶Mix（12.5μL）、模板DNA（2.5μL）、引物27F（1 μL）、引物1492R（1 μL）、dd H2O（8 μL）；PCR扩增条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸l.5 min，72℃延伸10 min，循环数为30。电泳检测扩增结果合格后，将PCR扩增产物送广州生工生物科技有限公司测序，并将测序结果在EzBicloud网站上与模式株比对，利用软件MEGA 7.0中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。

1.3.3 鱼肉水解液的制备

将新鲜蓝圆鲹切成小块后打浆，以鱼肉∶水∶食盐∶复合蛋白酶=100∶50∶10∶0.1的质量比混匀后，于60 ℃的水浴锅中酶解5h，定期用玻璃棒搅拌。再加入0.25%胰蛋白酶（牛胰）及20%的水于37℃条件下继续酶解4 h。酶解后先过200目筛，将滤液在4 500 r/min条件下离心10 min，再进行抽滤，得到澄清的鱼蛋白水解液并测定其盐度。再补加NaCl，使鱼蛋白水解液的盐度达到25%，然后经121℃，灭菌20 min。

1.3.4 耐盐乳酸菌的发酵

将从鱼露里筛选的耐盐乳酸菌先用含10%NaCl的MRS培养基培养48 h后，再转接至含20%NaCl的MRS培养基中继续培养至变浑浊后进行平板计数，再分别接种到已灭菌的鱼肉水解液样品中，使接种后的鱼肉水解液中乳酸菌总数大约为107CFU/mL，以不接种任何菌种的鱼肉水解液为空白对照，30℃，有氧条件下培养60 d，分别在培养0、5 d、15 d、30 d、45 d、60 d取样，每组3个平行。定期取样，用快速滤纸过滤后得待测液，进行后续各项指标的测定。发酵过程中定期无菌取样测定盐度，补加蒸发的水分以保持盐度恒定。

1.3.5 耐盐乳酸菌发酵性能研究

（1）pH值及总酸的测定

pH值测定采用数字式pH计测定；总酸测定参照国标GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》[14]中的方法进行。

（2）细菌数量的测定

采用平板计数法，利用含有10%NaCl的MRS培养基进行平板计数，计数结果单位为CFU/mL。

（3）盐度的测定

盐度的测定参照国标GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》[15]中的方法进行。

（4）氨基酸态氮的测定

氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AAN）的测定参照国标GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》[14]中的方法进行。

（5）挥发性盐基氮测定

挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）测定参照国标GB5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[16]中的微量扩散法。

（6）总可溶性氮的测定

总可溶性氮（total soluble nitrogen，TSN）的测定参照国标GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[17]中的凯氏定氮法。

（7）组胺含量的测定

样品衍生化处理：移取5mL发酵液于50mL的离心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，均质1 min，于3 000 r/min条件下离心10 min，转移上清液至容量瓶中，将沉淀重复提取一次。取1.0 mL提取液于5.0 mL棕色容量瓶中，依次加入2mol/L氢氧化钠溶液100μL、饱和碳酸氢钠溶液300μL和10 g/L丹酰氯溶液2 mL后，在40℃的条件下避光反应45 min。反应完毕后，加入100 μL氢氧化铵，静置30 min，用乙腈定容到5.0 mL，振荡混匀，取适量过0.22 μm滤膜后待测定。

组胺含量的测定采用高效液相色谱（high performanceiquid chromatography，HPLC）法[18]，其色谱条件为：DIKMA Spursil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温 35 ℃；流速1 mL/min；进样量20 μL；检测波长为254 nm。流动相为水（A）和乙腈（B），采用二元高压梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～10 min，65%B→71%B；10～25 min，71%B→74%B；25～50 min，74%B→81%B。根据保留时间定性，采用内标法定量。

（8）呈味核苷酸的测定

参照国标GB 5413.40—2016[19]《婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》中的HPLC法进行测定。其色谱条件为：色谱柱为Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30℃；流速1 mL/min；进样量20 μL；检测波长254 nm；流动相为磷酸盐缓冲液（1.20 mmol/L四丁基硫酸氢铵，0.01 mol/L磷酸二氢钾）∶甲醇=1 000∶40（V/V），用磷酸调pH值至3.2，等梯度洗脱。根据保留时间定性，采用内标法定量。

1.3.6 感官评定方法和标准

采用定量描述分析法（quantitative description analysis method，QDA）进行感官评定。感官评价小组由10人组成5男5女），10人经总时间≥2 h的培训后，分别对鱼露的色泽、透明度、气味（酯香味、酱香味、卤肉味、鱼腥味、腐臭味）和滋味（涩味、酸味、鲜味、甜味、咸味）进行感官评价，按1～7分进行评分，“1”代表完全没有所指的味道，“7”代表所指味道非常强烈。

1.3.7 数据处理

测定和分析结果采用SPSS 20.0和Excel 2007进行数据处理，结果采取均值±标准差形式，P＜0.05认为具有显著差异。采用MEGA7软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

通过筛选，发现5株菌在筛选平板上产生明显的溶钙圈，分别命名为菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。

2.2 菌种鉴定结果

菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的菌落形态及细胞形态结果见图1。由图1可知，单菌落后经革兰氏染色，均呈革兰氏阳性，细胞均呈球状，四联或成对。

图1 菌落形态(A)及细胞形态(B)Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)

将这5株菌测序获得的16S rDNA序列在EzBicloud网站上比对，找到与其同源性较高的模式菌株构建系统发育树，结果见图2。由图2可知，菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E与Tetragenococcus halophilus的进化距离最接近，菌株JL-F与Staphylococcus epidermidis在同一分支上，同时结合形态学鉴定结果，可以鉴定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）；菌株JL-F为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。

图2 5株耐盐菌基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of five salt-tolerant bacteria

2.3 耐盐乳酸菌的发酵性能研究

2.3.1 不同菌株发酵鱼肉水解液中pH值及总酸的变化

耐盐乳酸菌具有产乳酸的能力，从而使得鱼肉水解液的pH值发生改变。因此测定了鱼肉水解液中pH值，结果见图3。

图3 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵过程中pH变化Fig.3 Changes of pH value during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由图3可知，随着发酵时间的延长，鱼肉水解液中的pH值先下降后趋于平缓。发酵15 d后菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的pH值分别稳定在4.35、4.90、4.33、4.60、5.40。经SPSS分析，不同耐盐乳酸菌发酵得到的鱼肉水解液的pH值在不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。对照组的pH值基本保持稳定（pH 5.65）。

鱼肉水解液中总酸的测定结果见图4。由图4可知，不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉水解液中总酸的含量呈现逐渐上升后趋于稳定的趋势，总酸含量最高可达27.28mmol/100mL，而对照组的总酸一直稳定在8.00 mmol/100 mL。说明耐盐乳酸菌的代谢活动使得发酵液中的总酸含量增加。经SPSS分析，不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉蛋白水解液的总酸值不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。

图4 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵过程中总酸含量变化Fig.4 Changes of total acid contents during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.2 不同菌株发酵鱼肉水解液中菌落数的变化

鱼肉水解液中耐盐乳酸菌数量的测定结果见图5。由图5可知，发酵过程中，对照组中细菌数量始终为零，而5株耐盐乳酸菌的数量均呈现先上升后逐渐下降的趋势。这与UDOMSIL N等[20]将嗜盐四联球菌接种至鱼露中，提升其产品风味的研究中测得的细菌数量变化趋势一致。发酵后期，细菌数量急剧下降。分析原因可能是：一方面因为鱼肉水解液中的营养物质不断地被消耗，导致营养匮乏；另一方面菌体本身生长代谢过程中产生的某些次级代谢产物不利于其生长。经SPSS分析，不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉蛋白水解的菌落数在不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。

图5 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵过程中菌落总数的变化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colonies during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.3 不同菌株发酵鱼肉水解液中AAN、TVBN及TSN的变化

鱼肉水解液中接种不同耐盐乳酸菌发酵后AAN、TVBN、及TSN变化趋势分别见图6。

图6 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵过程中ANN(A)、TVBN(B)及TSN(C)含量变化Fig.6 Changes of ANN(A),TVBN(B)and TSN(C)contents during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由图6A可知，随着发酵时间的延长，发酵液中AAN的含量呈现先增加后趋于稳定的趋势，而对照组的AAN含量在0.20 g/100 mL上下波动。不同菌株发酵液中AAN的含量呈现的趋势基本一致。经SPSS分析，不同菌株发酵的鱼肉蛋白水解的AAN含量在不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。

由图6B可知，随着发酵时间的延长鱼肉水解液中挥发性盐基氮的含量逐渐上升，且接种表皮葡萄球菌JL-F的鱼肉水解液发酵至60d时，TVBN含量升至155.31mg/100mL。而对照组虽未接种菌种，但其TVBN含量也呈现逐渐上升的趋势，分析原因可能是鱼肉水解液中发生化学反应导致。经SPSS分析，不同菌株发酵的鱼肉蛋白水解的TVBN值在不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。

由图6C可知，接种不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉水解液中TSN含量呈现逐渐上升的趋势。而对照组的TSN含量基本稳定在11.3 g/100 mL。经SPSS分析，嗜盐四联球菌JL-B、JL-C、JL-D、JL-E发酵的鱼肉蛋白水解的TSN值在不同时间点均无显著差异（P＞0.05），但4株嗜盐四联球菌与表皮葡萄球菌JL-F均存在显著差异（P＜0.05）。

2.3.4 不同菌株发酵鱼肉水解液中呈味核苷酸检测结果

核苷酸对鱼贝类的风味有一定的影响，通常认为5′-肌苷酸二钠（inosine-5'-monophosphate，IMP）和5′-鸟苷酸二钠（guanosine-5'-monophosphate，GMP）是主要的呈味核苷酸。故本研究测定了发酵60 d的鱼肉水解液中核苷酸含量，其液相色谱图见图7。由图7可知，不同耐盐细菌发酵的鱼肉水解液中无IMP和GMP，分析原因可能是发酵液提供的酸性环境，使得IMP和GMP分解为肌酐和黄嘌呤[21]。

图7 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵60 d时呈味核苷酸含量检测高效液相色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of flavor nucleotides contents in hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.5 不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉水解液中组胺检测结果

组胺是水产品中最主要的生物胺[22]，主要由微生物的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧生成[23]，危及人体健康。故该研究对鱼肉水解液中组胺含量进行了测定，结果见图8。由图8可知，不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉水解液中未检测到组胺。而UDOMSIL N等[20]发现接种嗜盐四联球菌能降低鱼肉水解液中的组胺含量，这与本研究的测定结果不一致。分析原因可能是本研究采用的无菌的鱼肉水解液作为发酵原料，发酵过程中仅受接种菌株的影响。而UDOMSIL N等研究中使用的是未灭菌的鱼肉水解液，其中涉及的微生物不只是嗜盐四联球菌，组胺的生成可能是多种微生物共同作用的效果。由此推测，本研究中筛得的5株耐盐乳酸菌可能不产生组胺。

图8 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵60天时组胺含量检测液相色谱图Fig.8 HPLC chromatogram of histamine contents in fish hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.6 不同菌株发酵鱼肉水解液感官评价结果

对不同菌株发酵的鱼肉水解液进行感官评价，结果见图9。由图9可知，接种嗜盐四联球菌JL-B发酵的鱼肉水解液在其透明度、酯香、酱香、卤肉味、鲜味的得分分别为5.5、5.5、5.3、3.6、3.8，均高于其他菌株发酵的鱼肉水解液。接种嗜盐四联球菌JL-B的鱼肉水解液为浅棕色的透亮液体，有浓郁的酯香及酱香。该鱼肉水解液的鲜味、卤肉味可接受程度更高，但是甜味并非是最突出的。综合各种感官评价的指标发现，接种嗜盐四联球菌JL-B的鱼肉水解液被感官评价参与者的接受度最高。

图9 接种不同菌株的鱼肉水解液发酵60 d时感官评定结果Fig.9 Sensory evaluation results of fish hydrolysate inoculated with different strains after 60 d fermentation

3 结论

本研究从鱼露中筛选获得5株耐盐乳酸菌，编号分别为JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。通过形态学和分子生物学鉴定，鉴定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均为嗜盐四联球菌，菌株JL-F为表皮葡萄球菌。然后对5株耐盐乳酸菌的发酵特性进行了研究。结果表明：不同耐盐乳酸菌发酵的鱼肉蛋白水解的pH值、总酸度及菌落数在不同时间点均存在显著差异（P＜0.05）。5株耐盐乳酸菌发酵的鱼肉蛋白水解液的pH值、AAN和TVBN存在显著差异（P＜0.05），而TSN的含量并无显著差异（P＞0.05）。不同菌株发酵的鱼肉水解液中均未检测到呈味的IMP和GMP且未检测到组胺。经感官评价，4株嗜盐四联球菌存在差异，接种嗜盐四联球菌JL-B的鱼肉水解液在风味和气味上被消费者接受的程度更高。

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