益生菌发酵胡萝卜汁活性成分与抗氧化活性研究

陈永芳，胡荣康，2，吴林秀，2，巫梦婷，钟思敏，刘 斌，2*

（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；

2.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002）

胡萝卜是伞形科胡萝卜属的一年生或两年生的草本植物，具有很高的营养价值[1]。其含有丰富的蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、β-类胡萝卜素和维生素C，其中维生素的含量达1%。但是由于胡萝卜自身的异味以及贮藏过程中会产生辛辣味的口感，并不能被大众所接受[2]。乳酸菌发酵在过去的几十年里因其提高原料的营养、生理和风味等特性而受到越来越多的关注[3]。

已有报道指出[4]，乳酸菌在果蔬发酵过程中对营养功能成分能够产生有益影响，其中包括酚类物质、有机酸和游离氨基酸等。SEELAM D N S等[5]用天然分离的球形芽孢杆菌发酵胡萝卜汁，发现发酵液中的总酚和抗氧化性都要高于未发酵组，并且菌株存活率达到7.8×107CFU/mL，表现出良好的感官品质和丰富的营养成分。徐萌萌[6]从发酵胡萝卜汁中检测发现了16种游离氨基酸，并且含有6种必需氨基酸，游离氨基酸总含量达到8.836 mmol/kg。王俊华等[7]研究发酵前后胡萝卜汁中的有机酸含量变化发现，乳酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸含量增加，推断其可能是乳酸菌发酵过程中的主要代谢物。胡萝卜富含丰富的β-类胡萝卜素和维生素C因而具有较强的抗氧化性，不仅如此，研究发现乳酸发酵能够防止抗坏血酸的降解，同时能够维持总抗氧化能力[8]。

本研究利用鼠李糖乳杆菌对胡萝卜汁进行发酵，比较发酵前后酚类物质含量、有机酸、游离氨基酸、抗氧化活性的变化情况，以期为发酵胡萝卜汁的深度开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）：中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号1.3724。

1.1.2 药品及试剂

没食子酸、儿茶素、绿原酸、槲皮素、山奈酚、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸标准品：上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源叶生物有限公司；其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Eyelan-1100旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；Agilent 1260高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国Agilent公司；DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日本HITACHI公司；Uvmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；MK3酶标仪：美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 制备发酵胡萝卜汁

新鲜制备的胡萝卜汁，使用NaHCO3调节pH至6.5，在80℃条件下杀菌20 min，所得果汁冷却后加入葡萄糖至终质量分数为10%，4℃条件下储存。

向1 L胡萝卜汁中接入约106CFU/mL鼠李糖乳杆菌，将接种后的胡萝卜汁放置在37℃恒温培养箱内静置发酵培养48 h至发酵果蔬汁中含有约109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌，将相同实验条件下以未接种的胡萝卜汁作为对照。

1.3.2 鼠李糖乳杆菌发酵对胡萝卜汁中酚类物质影响

参照PAIVA F F等[9]的方法并略有修改，提取发酵前后游离态酚类物质，HPLC进行测定。向50 mL胡萝卜汁中加入2倍体积冰预冷的体积分数80%丙酮，均质后离心收集上清液，将上清液旋蒸至无水状态后，用双蒸水溶解残余物，定容至10 mL，HPLC测定含量。

参照FINOCCHIARO F等[10]的方法并略有修改，提取发酵前后结合态酚类物质，HPLC进行测定。向50 mL胡萝卜汁中加入2倍体积冰预冷的体积分数80%丙酮，均质后离心收集沉淀，加入40 mL 4 mol/L NaOH溶液，充入适量氮气后密封振荡3h，加入6mol/LHCl溶液调节pH值至1，抽滤去除残渣后加入2倍体积乙酸乙酯萃取5次，45℃条件下旋蒸至无水状态，用水溶解残余物，定容至10 mL，HPLC测定含量。

1.3.3 鼠李糖乳杆菌发酵对胡萝卜汁中有机酸的影响

称取0.5 g发酵前后的样本液，加入0.5 mL预冷的乙酸乙酯，移入EP管内，超声提取60 min，离心取上清液，残渣用0.2 mL乙酸乙酯超声20 min，离心取上清，合并上清，用乙酸乙酯定容至1 mL，混匀，针头式过滤器过滤后HPLC进行测定。

1.3.4 鼠李糖乳杆菌发酵对胡萝卜汁中游离氨基酸的影响

吸取5mL样本液至水解管中，向水解管内加5mL6mol/L HCl混匀后，继续加入5 mL 6 mol/L HCl，向水解管内滴加3～4滴苯酚。将水解管冷冻3～5min，接到真空泵的抽气管上，0 Pa抽真空后充入氮气，重复抽真空，充入氮气3次后将水解管封口。将封口的水解管放在110℃电热鼓风干燥箱内水解22 h，自然冷却至室温。

打开水解管，将水解液过滤至50 mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，合并水洗液和水解液，用水定容至50 mL，振荡混匀。吸取1 mL滤液移入至15 mL试管内，在45℃条件下减压干燥，干燥后残留物用1 mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。向干燥后的试管内加入1 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液，振荡混匀后过0.22 μm滤膜，用于氨基酸自动分析仪检测。

1.3.5 测定方法

清除DPPH自由基能力：按照参考文献[11]的方法进行测定。

DPPH自由基的清除率=

式中：Ax为样品与DPPH反应的吸光度值；Ax0为用蒸馏水代替DPPH的吸光度值；A0为蒸馏水代替样品的吸光度值，重复3次。

清除羟基自由基能力：按照参考文献[12]的方法进行测定。

羟基自由基清除率=

式中：Ax为样品的吸光度值；Ax0为用蒸馏水代替H2O2的吸光度值；A0为蒸馏水代替样品的吸光度值，重复3次。

总还原力的测定：按照参考文献[13]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵前后胡萝卜汁中的酚类物质的比较

鼠李糖乳杆菌发酵胡萝卜汁发酵前后结合态和游离态的多酚和黄酮含量变化情况见图1。由图1可知，鼠李糖乳杆菌发酵后胡萝卜汁中的游离态酚类物质含量明显增加（P＜0.05），而结合态酚类物质的含量明显下降（P＜0.05），发酵后没食子酸、儿茶素、绿原酸、槲皮素和山奈酚的含量分别为（0.21±0.02）μg/mL、（7.85±0.18）μg/mL、（150.54±6.52）μg/mL、（0.65±0.10）μg/mL和（0.19±0.02）μg/mL，比未发酵胡萝卜汁中酚类物质含量分别提高了34.17%、14.77%、9.94%、243.91%和49.18%，槲皮素的含量明显升高。

图1 鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁中结合态和游离态的多酚和黄酮含量变化Fig.1 Changes of the contents of combined and free polyphenols and flavonoids in carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus

2.2 乳酸菌发酵前后胡萝卜汁中的有机酸含量的比较

鼠李糖乳杆菌发酵胡萝卜汁发酵前后有机酸的含量变化情况见图2。由图2可知，鼠李糖乳杆菌发酵后胡萝卜汁中的草酸含量没有明显变化，发酵后乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸和丁酸含量明显增加（P＜0.05），相较于未发酵中有机酸含量分别增加了0.463 mg/mL、5.376 mg/mL、0.256 mg/mL、1.009 mg/mL、0.371 mg/mL、0.218 mg/mL和0.312 mg/mL。

图2 鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁中有机酸含量变化Fig.2 Changes of organic acid content in carrot juice before and after the fermentation withL.rhamnus

2.3 益生菌发酵前后胡萝卜汁中的游离氨基酸含量的比较

鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁中的游离氨基酸种类及含量的变化情况见表1。由表1可知，发酵前胡萝卜汁中共检测到17种氨基酸，含量最高的分别是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸。发酵后胡萝卜汁中游离氨基酸与发酵前相比，苏氨酸[（0.13±0.004 8）mg/g]、丝氨酸[（0.25±0.006）mg/g]、甘氨酸（（0.34±0.008 4）mg/g]、蛋氨酸[（0.05±0.007）mg/g]和赖氨酸[（0.12±0.0044）mg/g]这5种氨基酸含量明显升高（P＜0.05）；天冬氨酸（（0.3±0.0036）mg/g）和谷氨酸[（0.46±0.007）mg/g]含量呈明显下降趋势（P＜0.05）。

表3 鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁中游离氨基酸含量变化Table 3 Changes of free amino acids content in carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus mg/g

2.4 益生菌发酵对胡萝卜汁的抗氧化活性的影响

鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁对DPPH自由基和羟基自由基的清除率见图3。由图3可知，发酵后的胡萝卜汁的抗氧化活性明显增加（P＜0.05），与发酵前后酚和黄酮含量的变化趋势相符。发酵后的胡萝卜汁对DPPH和羟基自由基的清除率分别为70.6%和26.45%，相比起发酵前的清除率分别提高了30.42%和21.45%。

图3 鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁对DPPH、羟基自由基清除率变化Fig.3 Changes of free radical scavenging rate of carrot juice on DPPH and hydroxyl free radical before and after fermentation withL.rhamnus

鼠李糖乳杆菌发酵胡萝卜汁前后总还原力的变化见图4。由图4可知，总还原力在发酵后显著增加（P＜0.05）。发酵后胡萝卜汁的总还原力的吸光度值为0.58±0.01，发酵后的胡萝卜汁比发酵前总还原力提高了28.89%。

图4 鼠李糖乳杆菌发酵前后胡萝卜汁总还原力变化Fig.4 Changes of total reducing power of carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus

3 讨论

乳酸菌是人和动物肠道内最重要的益生菌群，乳酸菌发酵能够释放果蔬中的酚类物质、有机酸和游离氨基酸等功能性物质的含量，提高生物利用率、增强抗氧化性和抑制糖尿病相关酶的能力。

酚类是一种易被氧化的物质，能够有效的在细胞和生理水平上防止氧化[14]。果蔬中的酚类物质主要以游离态和结合态存在，CHU Y F等[15]对胡萝卜中酚类物质含量和抗氧化能力的研究表明胡萝卜中的酚类物质以游离态为主，结合酚的含量同样占总酚含量的24%左右。目前，相较于结合酚，游离酚因其易开发，生理活性强的特点受到越来越多的关注。乳酸菌发酵时产生阿魏酸酯酶等酚酸酯酶水解果蔬中的部分结合酚，释放果蔬中的游离酚，并且释放大量的有机酸，防止酚类物质的降解，从而提高了抗氧化活性。某些乳酸菌在发酵过程中，也会产生一些酚酸脱羧酶，这种能使酚类物质之间相互转化。由此可见，乳酸菌发酵而导致果蔬酚类物质间的相互转化，能明显改变其抗氧化性[16]。

乳酸菌发酵主要通过同型发酵和异型发酵两种代谢途径。同型发酵过程中乳酸菌参与糖酵解、三羧酸循环等途径产生乳酸，并且伴随丙酮酸和琥珀酸等部分中间产物[17]。异型发酵过程中乳酸菌除了产生乳酸和乙酸等主要产物之外，还会产生少量的甲酸、丁酸和琥珀酸等代谢产物[18]。胡萝卜汁经过鼠李糖乳杆菌发酵后乳酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量明显增加（P＜0.05），而苹果酸的含量显著减少（P＜0.05），这可能涉及到乳酸菌发酵过程中的一种特殊代谢途径（苹果酸-乳酸发酵）[19]。本研究结果表明，鼠李糖乳杆菌在发酵胡萝卜汁过程中，苹果酸转化为乳酸，苹果酸含量由发酵前的（0.506±0.045）mg/mL下降为发酵后的（0.043±0.002）mg/mL。

胡萝卜汁经过鼠李糖乳杆菌发酵后天冬氨酸和谷氨酸的含量明显下降。七谷圭等[20]发现某些乳酸菌能够将天冬氨酸置换成丙氨酸，不仅能够增强菌的繁殖力还能够降低酸味增加适口性。谷氨酸是合成γ-氨基丁酸重要的前体物质，乳酸菌发酵能够将谷氨酸转化成为具有降血压功能的γ-氨基丁酸[21]。

4 结论

本实验初步探讨了鼠李糖乳杆菌在果蔬发酵过程中对其活性成分与抗氧化活性的影响，结果表明，鼠李糖乳杆菌发酵后胡萝卜汁中的游离态酚类物质含量明显增加（P＜0.05），而结合态酚类物质的含量明显下降（P＜0.05），其中槲皮素相较于发酵前提高了243.91%；发酵后乳酸含量最高，比发酵前提高了5.376 mg/mL；发酵后苏氨酸（0.13mg/g）、丝氨酸（0.25mg/g）、甘氨酸（0.34mg/g）、蛋氨酸（0.05mg/g）和赖氨酸（0.12mg/g）含量均明显升高（P＜0.05）。

发酵后的胡萝卜汁对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为70.6%和26.45%，比发酵前分别提高了30.42%和21.45%。

发酵后的胡萝卜汁总还原力吸光度值为0.58±0.01，比和发酵前提高了28.89%。

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