3种虫生真菌菌丝的游离氨基酸分析

徐 军，汪家春*，李兆兰，王 玥，陈雅琳

（1.上海健康医学院医疗器械学院，上海 200093；2.中国人民解放军海军医学研究所，上海 200433；3.南京大学 生命科学学院，江苏 南京 210093；4.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

游离氨基酸又称非蛋白质氨基酸，呈游离状态，其种数远远超过蛋白质氨基酸。游离氨基酸是许多中药材的重要有效成分，广泛分布于植物、动物、微生物体内。游离氨基酸具有重要的生物功效和药用价值，作为临床医疗和药用也超过蛋白质氨基酸[1-2]。目前，真菌菌丝体的氨基酸分析主要着重于食用菌蛋白质氨基酸的分析，缺少对菌丝体的游离氨基酸组成的系统研究。有学者对虫生真菌的蛋白氨基酸进行了分析，但是少见对虫生真菌游离氨基酸的分析。因此虫生真菌中各种游离氨基酸的种类和含量的分布状况，将可作为评价该虫生真菌菌丝的保健和药用功效的重要指标，为虫生真菌资源利用和应用价值的评价提供技术和理论参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种

3种虫生真菌的菌种：从冬虫夏草的菌核和子座的菌丝组织经组织分离和克隆而获得的纯菌种，将试管母种通过扩培，人工发酵培养而获得大量菌丝体。菌丝经过冷冻干燥、粉碎制成发酵菌粉，4℃保存备用。

1.1.2 试剂

氨基酸标准品（24种），邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、氯甲酸芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC）（均为分析纯）：美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：中国药品生物制品鉴定所；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent1200型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国安捷伦科技公司；HypersilGold C18柱（250mm×4.6 mm，5μm）：美国赛默飞世尔公司；D2900旋转式振荡器：江苏省太仓市强乐实验设备厂；CP225D电子分析天平：德国赛多利斯公司；JL型超声波清洗器：上海杰理科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

24种氨基酸混合标准溶液：精密称取24种氨基酸标准品各5 mg，加0.1 mol/L HCl溶解并定容至50 mL，制成24种氨基酸标准品混合溶液。1.3.2衍生化试剂的配制

OPA衍生试剂：精密称取10 mgOPA，溶于1 mL混合液0.16 mL甲醇，0.14 mL硼酸缓冲液，0.69 mL纯水，0.01 mL 3-巯基丙酸）混匀，过0.45 μm微孔滤膜，现用现配。

FMOC衍生试剂：精密称取10 mg FMOC，溶于1 mL乙腈，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，现用现配。

硼酸缓冲液：称取2.48 g硼酸，加入约1.2 g NaOH，加水溶解并定容至100 mL，用2 mol/LNaOH溶液调节pH值至10，4℃冰箱保存。

1.3.3 样品溶液的制备

准确称取菌丝粉200mg，加入体积分数80%的乙醇，60℃超声提取30min，离心过滤，滤液定容至10 mL作为样品液，4℃保存时间不超过24h。上柱前样品液加邻苯二甲醛（OPA）和氯甲酸芴甲酯（FMOC）混合，自动衍生化，然后上柱。

1.3.4 HPLC测定游离氨基酸的种类及含量分析

色谱条件：色谱柱为Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温40℃，检测波长338 nm，流动相A：20 mmol醋酸钠，0.3%四氢呋喃，0.02%三乙胺；流动相B：100 mmol/L醋酸钠∶甲醇∶乙腈=200∶450∶350，pH 2.2。梯度：0→60 min，B相5%→56%；64→68 min，B相100%，流速1.0 mL/min。外标法定量，计算各种游离氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 HPLC测定24种氨基酸的图谱

24种游离氨基酸标准品的高效液相色谱图见图1；蝙蝠蛾拟青霉、中国弯颈霉及中国被毛孢游离氨基酸的高效液相色谱图见图2。

图1 24种氨基酸对照品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatography of 24 amino acids reference substances

图2 蝙蝠蛾拟青霉（A、B）、中国弯颈霉（C、D）、中国被毛孢（E、F）游离氨基酸的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatography of free amino acids inPaecilomyces hepiali(A、B),Tolypocladium sinensis(C、D),Hirsutella sinensis(E、F)

2.2 三种虫生真菌菌丝的游离氨基酸的种类和含量

3种虫生真菌菌丝的游离氨基酸的种类和含量比较见表1、表2。

表1 3种虫生真菌菌丝游离氨基酸种类和含量和对照品的保留时间Table 1 Types and contents of free amino acids in mycelia of 3 entomogeneous fungi and retention time of standard

表2 3种虫生真菌菌丝游离氨基酸含量比较Table 2 Comparison of free amino acids contents in mycelia of 3 entomogeneous fungi

由表1、表2可知，蝙蝠蛾拟青霉含20种游离氨基酸，缺少组氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺及牛黄酸这4种游离氨基酸；中国弯颈霉含23种游离氨基酸，缺少组氨酸；中国被毛孢含22种游离氨基酸，缺少瓜氨酸、γ-氨基丁酸，三者所缺游离氨基酸的种类不同。蝙蝠蛾拟青霉有7种游离氨基酸含量高于其他2种虫生真菌菌丝，分别是天冬氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸；中国弯颈霉有15种游离氨基酸含量高于其他2种虫生真菌菌丝，分别是谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、牛黄酸、γ-氨基丁酸、色氨酸等，中国被毛孢中组氨酸含量最高。蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉的鸟氨酸含量相同（0.21 mg/g）且高于中国被毛孢。3种虫草菌丝各自含量最高的游离氨基酸同是丙氨酸、脯氨酸，各自含量最低的游离氨基酸同是瓜氨酸和鸟氨酸。且都含有8种必需氨基酸。3种虫草菌丝在24种游离氨基酸含量分布的幅度和幅差上有明显差别，中国弯颈霉的游离氨基酸含量为0.21～5.62mg/g，幅差为5.41mg/g；蝙蝠蛾拟青霉的游离氨基酸含量为0.98～2.85 mg/g；幅差为2.67 mg/g；中国被毛孢的游离氨基酸含量为0.080～1.82 mg/g；幅差较小为1.74 mg/g。

2.3 三种虫生真菌菌丝的重要类别的游离氨基酸含量比较

表3 3种虫生真菌菌丝重要游离氨基酸含量比较Table 3 Comparison of essential free amino acids content in mycelia of 3 entomogeneous fungi

由表3可知，中国弯颈霉游离氨基酸总量及非必需游离氨基酸总量均最高，分别为37.29mg/g和29.68mg/g；其次是蝙蝠蛾拟青霉，分别为19.24mg/g和11.27mg/g；中国被毛孢含量较低，分别为13.07 mg/g和9.36 mg/g。蝙蝠蛾拟青霉必需游离氨基酸含量为7.97mg/g，中国弯颈霉为7.61mg/g，二者含量相接近；中国被毛孢为3.71mg/g。蝙蝠蛾拟青霉支链氨基酸含量最高为3.66mg/g，其次是中国弯颈霉（2.57%），再次是中国被毛孢（1.63 mg/g）。蝙蝠蛾拟青霉必需氨基酸占氨基酸总量和占非必需氨基酸总量的百分含量最高，分别为41.42%和70.71%；其次是中国被毛孢，分别为28.38%和39.62%；再次是中国弯颈霉，分别为20.41%和25.57%。中国弯颈霉的精氨酸含量为1.25 mg/g，牛磺酸含量为1.82mg/g；蝙蝠蛾拟青霉的精氨酸含量为1.03 mg/g，牛黄酸缺失；中国被毛孢的精氨酸含量为0.22 mg/g，牛黄酸含量为0.86 mg/g，后二者均低于中国弯颈霉。蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉的赖氨酸的含量接近，分别为0.98 mg/g和0.92 mg/g；中国被毛孢含量为0.62 mg/g，较前二者低。2.4重要游离氨基酸的功能解析

支链氨基酸是侧链具有分枝的氨基酸，即缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸三种，支链氨基酸是治疗很多重大疾病的有效氨基酸，特别是肝病的治疗效果尤为显著[3-6]。蝙蝠蛾拟青霉的支链氨基酸含量最高为3.66 mg/g。

精氨酸是一种半必需氨基酸，也是一种条件必需氨基酸，对新生儿也是一种必需氨基酸，精氨酸具有促人体激素分泌的作用，口服或静脉注射可促进垂体生长激素的分泌增加，应用于治疗身材矮小症。精氨酸是促进胰岛素生成作用最强的一种制剂，口服或静脉注射可促进胰岛素的释放明显增多，可用于糖尿病的治疗[7]。中国弯颈霉和蝙蝠蛾拟青霉的精氨酸含量较丰富，分别为1.25 mg/g、1.03 mg/g。

牛磺酸是一种重要的游离氨基酸，它可清除自由基、降血脂、减少动脉粥样硬化、预防冠心病的发生，可防止心肌缺血、抗心律失常、预防心衰、防止心肌梗死。牛磺酸可促进大脑发育、提高记忆力[7]。中国弯颈霉的牛磺酸含量比较高为1.82 mg/g。

组氨酸可促细胞再生作用，增进胃液分泌，用于治疗胃溃疡和十二指肠溃疡[8-10]。中国被毛孢含一定量的组氨酸为0.21 mg/g。

3 结论

关于虫生真菌的氨基酸分析报道较少，已发表的文献资料仅限于对虫生真菌的16种常见的氨基酸的分析[11-13]，本实验对3种重要虫生真菌的24种游离氨基酸分析，其游离氨基酸种类和含量有一定的差别，显然对三者的药效作用有显著影响，所以3种虫生真菌各有自主性和特异性，但有弥补和互补作用。虫生真菌种类多、数量大、分布广，迄今我国共记载约400种虫生真菌，占全世界种类的一半左右[14]，虫生真菌的开发和应用具有光明前景。虫生真菌的氨基酸研究和分析对保健品和药品的开发和应用提供了一类新的生物资源和天然来源，具有一定的新颖性[15-16]。

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