骨骼肌急性钝挫伤修复过程中自噬相关因子的表达变化*

2018-06-08唐成林黄思琴赵丹丹张安宁郭全虎高睿琦

中国应用生理学杂志 2018年2期

罗翱，唐成林，黄思琴，赵丹丹，张安宁，郭全虎，高睿琦，曹净

（重庆医科大学中医药学院，重庆400016）

骨骼肌是人体体量最大的组织，直接参与人体的各项生命活动。近年来，由于交通、体育等行业的发展，骨骼肌损伤的发病率逐年上升。90%的骨骼肌损伤属于钝挫伤或牵拉伤［1］，而最常见的运动损伤中就是急性骨骼肌钝挫伤，尤其以股四头肌和腓肠肌损伤最常见［2］。骨骼肌损伤主要表现为肌纤维的断裂和肌细胞的溶解，其损伤修复时间较长，愈后较差，甚至造成骨骼肌功能和结构的不可逆损害，严重影响患者的日常生活。基于此，国内外学者对骨骼肌损伤修复相关机制进行大量的研究，但尚未得到统一观点和意见。

目前，自噬是国内外研究的热点和难点。自噬是指细胞在自噬相关基因的调控下，通过溶酶体途径降解自身衰老、变性及凋亡的细胞器和大分子物质，从而维持细胞内环境的稳定［3］。自噬既可以作为一种适应性机制，清除老化的和折叠错误的蛋白质及受损的线粒体等细胞器，也能在一定程度上促进细胞增殖和迁移［4］。实际上，自噬的过程就是细胞内容物被降解成核苷酸、氨基酸及游离脂肪酸，从而被细胞再次利用，为大分子物质的合成和ATP的产生提供必需的原材料的过程［5］，通常也认为该过程是促进细胞存活的过程［6］。本课题组前期对骨骼肌损伤修复机制进行大量的研究，主要集中在炎症水平、肌卫星细胞增殖分化及细胞膜修复等方面［7-9］，本实验拟通过建立大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型，观察损伤前后不同时间点细胞自噬相关因子表达的变化，以期补充并完善骨骼肌损伤修复的相关机制，为临床治疗骨骼肌钝挫伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SPF级雄性SD大鼠30只，体重（200±20）g，由重庆医科大学动物实验中心提供（SCXK（渝）2012-0001）。实验动物饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房，室内保持光照、黑暗12 h昼夜节律，室温（22±1）℃，相对湿度50%～60%，自由饮食饮水。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：4%多聚甲醛（Biosharp生物科技公司）；2.5%戊二醛（重庆医科大学电镜室）；苏木精-伊红（HE）染液（北京索莱宝科技有限公司）；各基因引物、逆转录试剂盒、SYBR Green、Trizol、DEPC水（Takara-宝生物工程（大连）有限公司）；氯仿、异丙醇（重庆川东化工（集团）有限公司）；各蛋白质一抗、各蛋白质二抗（Cell Signaling Technology（CST））；抗体增强液（TOYOBO）；ECL发光液（Millipore）；脱脂奶粉（伊利集团）。

主要仪器：台式高压蒸汽灭菌锅、恒温孵育箱（上海精宏实验设备有限公司）；生物显微镜、图像采集系统（Olympus）；Hitachi-7500型透射电镜（重庆医科大学电镜室）；匀浆器（IKA）；低温离心机（长沙湘仪离心机有限公司）；全波长酶标仪（BioTek）；金属浴、温控摇床（江苏海门市其林贝尔（Qilinbeier）仪器制造有限公司）；Bio-Rad标准电泳装置、实时荧光定量 PCR仪（Bio-Rad）；Odyssey Fc发光仪（Gene Company Limited）。

1.3 大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型复制

参考Kami K［10］的造模方法。自备打击器，打击器为一打击面平坦的空心铝制圆柱体（直径1 cm，长20 cm，质量20 g），底面与木制圆柱体相接（直径1 cm，长2 cm，质量2 g），木制打击面与打击部位直接接触，自制铁球640 g，从25 cm高处落下，重力6.27 N，产生动能1.57 J。造模前用小动物剃毛器剔除大鼠右小腿内侧皮肤被毛。乙醚麻醉后，将大鼠右小腿外展屈曲90°固定，打击部位为右小腿内侧面（其皮下为腓肠肌中段），抽出铁片使铁球下落导致一次性打击伤并标记。造模后通过大体观察、触诊及病理学检测，证实腓肠肌有一定收缩功能障碍且无骨折，属急性腓肠肌钝挫伤模型。重力锤的投放和大鼠的固定均由一人操作，以保证打击力度、损伤部位及程度的一致性。

1.4 分组及取材

30只SD大鼠适应性喂养一周后，随机选取6只作为对照组，对照组于造模前一天取材。其余24只大鼠制备腓肠肌急性钝挫伤模型，然后随机分为4组（n＝6），各组分别在造模后 3 d、5 d、7 d、14 d取材。取材前，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.5 ml／200 g体重）麻醉，解剖并分离大鼠右侧腓肠肌，迅速将离体的腓肠肌放在干净的滤纸上均分为3份，一份置2.5%戊二醛中固定，待做透射电镜检测；另一份置4%多聚甲醛中固定，以备石蜡包埋、冰冻切片及HE染色；第三份置液氮中速冻2 h，然后转移到-80℃冰箱保存，以备Western blot及RT-PCR检测。

1.5 腓肠肌组织HE染色及病理学评价

将各组大鼠经4%多聚甲醛固定的腓肠肌取出，自来水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片并进行HE染色。光学显微镜下观察各组大鼠腓肠肌组织形态学变化，并用图像采集系统获取所需图片，进行组织学和病理学分析。

1.6 腓肠肌组织透射电镜观察及形态学评价

取经2.5%戊二醛固定的腓肠肌，使用pH 7.2的磷酸缓冲盐溶液漂洗3次，1%锇酸固定2 h，4℃下梯度酒精（50%、70%、90%，100%）脱水；置换（环氧丙烷，环氧丙烷和树脂1∶1混合液，环氧丙烷和树脂1∶4混合液，纯树脂）；环氧树脂包埋后制作半薄切片（甲苯胺蓝染色-光镜下定位-定位于横切）；超薄切片机切片后铜网捞片，3%醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色法染色。待样品干燥后，透射电镜观察受损肌组织超微结构变化并进行分析。

1.7 Western blot检测自噬相关蛋白质表达水平

自-80℃取出适量腓肠肌组织，加入裂解液匀浆，离心取上清，BCA法测定蛋白质浓度，在一定量上清液中加入缓冲液后金属浴10 min，置于冰上待上样。SDS-PAGE分离蛋白质，电转移至PVDF膜，置摇床上用5%脱脂奶粉封闭1 h。轻轻冲洗PVDF膜，将其置一抗稀释液中4℃摇床上孵育过夜。次日用TBST洗膜10min×3次，加对应的二抗稀释液置摇床上室温孵育1 h，用TBST洗膜10 min×3次。将ECL化学发光液均匀涂于膜上反应2min，置发光机中曝光显影成像，以Image Studio Ver 5.0软件统计灰度值并进行分析。

1.8 RT-PCR检测自噬相关基因mRNA表达水平

自-80℃冰箱取出各组大鼠腓肠肌组织约30 mg，加入1ml Trizol试剂匀浆，依次加氯仿，振荡，离心取上清；加异丙醇，振荡，离心弃上清，75%酒精洗涤2次，晾干；加适量DEPC水溶解RNA并弹匀离心，随后测定RNA浓度。根据逆转录体系调整RNA浓度并计算逆转录所需上样量，而后逆转录合成cDNA，反应条件：37℃、15min、85℃、5 s、4℃、∞。按SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）配置反应混合物后，根据反应体系所需量上样并进行RTPCR扩增，上机条件：预变性（95℃、30 s）；扩增（95℃、5 s，60℃、30 s）；溶解曲线（95℃、5 s，60℃、1 min）。通过CFXmanager 3.1软件读取Ct值。各基因引物序列如表1。

Tab.1Primer sequences of RT-PCR

1.9 统计学处理

实验数据用均数 ±标准差）表示，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），以LSD法进行组间两两比较。

2 结果

2.1 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠组织变化情况

HE结果（图1，见彩图页Ⅰ）显示：对照组大鼠骨骼肌肌纤维呈钝角多边形，肌细胞大小结构均一，胞核大多位于细胞边缘，肌节结构完整，肌丝排列整齐（图1A）。与对照组比较，其余各组均可见大量肌纤维溶解及炎细胞浸润（图1A-E）。自然恢复3 d组，同一视野下可见少量的成肌细胞，且肿胀明显，另有大量的炎细胞浸润（图1B）。自然恢复5 d组与3 d组比较差异不大，依然存在大量的炎细胞浸润，肌纤维断裂溶解现象也较明显，肌细胞明显变形，细胞出现崩解和萎缩（图1C）。自然恢复7 d组，可见部分新生肌细胞和小血管，细胞排列相对紧密但较紊乱，其间可见明显的结缔组织填充，炎细胞浸润减轻（图1D）。自然恢复14 d组，可见肌纤维排列整齐且致密，有轻微肿胀，肌纤维大小结构均一，细胞核移至细胞边缘，损伤部位初步愈合（图1E）。

电镜观察结果（图2）显示：对照组肌原纤维无异常，肌节排列整齐，明暗带相间，线粒体横向排列于Z带附近，形态无异常，肌质网无扩张，可见明显的三联体（图2A）。自然恢复3 d组，可见线粒体明显肿胀，且结构异常，嵴变性，空泡化，肌原纤维部分溶解变形，Z线部分消失且排列紊乱，肌质网轻度扩张（图2B）。自然恢复5 d组，可见大面积的线粒体肿胀，排列紊乱，肌原纤维小灶状丢失，Z线大多消失且部分飘移，呈近似水纹状改变，肌质网扩张明显（图2C）。自然恢复7 d组，线粒体肿胀依旧明显，Z线消失或部分增粗，肌质网扩张明显，肌原纤维排列依旧紊乱（图2D）。自然恢复14 d组，可见稍清晰的Z线，形态近似于对照组，线粒体肿胀减轻、嵴疏松变性明显，线粒体排列向Z线两侧移位，肌质网扩张减轻但仍较对照组明显（图2 E）。

Fig.2 The gastrocnemius electronmicroscopy of the control group and the natural recovery group for 3 d，5 d，7 d，14 d（×20 000，scale＝1μm）

2.2 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠自噬相关蛋白质LC3-II、P62表达的变化

Western blot结果（表2）显示，在骨骼肌钝挫伤自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d过程中，LC3-II与 P62总体呈现先升高后降低的变化趋势。其中，与对照组和自然恢复14 d组比较，自然恢复3 d、5 d、7 d组LC3-II表达水平显著升高（P＜0.01），3 d、7 d组也较5 d组明显升高（P＜0.01）。同样，与对照组相比，在损伤后第3天 P62达到高峰（P＜0.01），损伤后第5天表达开始下降但仍明显高于对照组（P＜0.05），14 d组P62表达已恢复至正常水平。

Tab.2 The relative expression levels of LC3-II and P62 in gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery groups for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup；＃＃P＜0.01 vs14 d；△△P＜0.01 vs 5 d；▲▲P＜0.01 vs 3 d

Group LC3-II P62 Con 0.376±0.126 0.260±0.067 3 d 1.195±0.064**＃＃△△ 4.783±1.207**＃＃5 d 0.946±0.078**＃＃ 1.560±0.392*▲▲7 d 1.284±0.115**＃＃△△ 1.285±0.196▲▲14 d 0.351±0.076 0.788±0.289

2.3 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠自噬相关基因atg7、atg10、atg12、atg16L1mRNA表达的变化

RT-PCR结果（表3）显示，骨骼肌钝挫伤在自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d这一过程中 atg10mRNA表达呈现先降低后升高的趋势，其中3 d、5 d、7 d组明显低于对照组与 14 d组（P＜0.01）。atg7、atg12、atg16L1mRNA表达总体呈现先升高后降低的趋势，3 d、5 d、7 d各组明显高于对照组与14 d组（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；与 5 d组比较，3 d、7 d组atg7与atg12mRNA表达量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与对照组比较，自然恢复 14 d组 atg7、atg12、atg16L1mRNA表达呈下降趋势，但无统计学差异。

Tab.3 The relative expression levels of atg7，atg10，atg12 and atg16 L1in the gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery group for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 14 d；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 5 d

Group atg7 atg10 atg12 atg16L1 Con 1.003±0.093 1.007±0.149 1.002±0.082 1.010±0.182 3 d 5.117±0.380**＃＃△ 0.276±0.112**＃＃ 3.941±1.071**＃＃△ 2.806±0.426**＃＃5 d 3.753±1.167**＃＃ 0.360±0.231**＃＃ 2.573±0.884*＃＃ 3.176±1.083**＃＃7 d 6.307±0.937**＃＃△△ 0.249±0.001**＃＃ 3.409±0.227**＃＃ 3.071±0.135**＃＃14 d 0.626±0.100 1.268±0.202 0.674±0.028 0.715±0.107

3 讨论

起“管家机制”作用的自噬一直是国内外研究的热点及难点。目前，哺乳动物自噬的发生机制尚未完全阐明。但在酵母中已鉴定出约30多种与自噬相关的基因，同样在哺乳动物中也已鉴定出一些同源基因而且也具有一定的功能［11，12］。在生理状态下，几乎所有的细胞都存在基础水平的自噬现象，以便清除未折叠或折叠错误的蛋白质，降解大分子物质，为细胞重建、再生和修复提供必需的原材料，实现物质的循环再利用，维持细胞内环境的稳定。但在某些特殊状态下，例如缺血缺氧、氧化应激、DNA损伤，饥饿等条件下，细胞会上调自噬以清除损伤的细胞器，实现能量的再利用，抑制凋亡因子的释放，减少细胞损害［13］。

自噬的核心分子机制主要由atg相关基因及自噬微管相关蛋白1轻链3组成，在自噬级联反应数个连续步骤中起编排功能。本实验通过建立骨骼肌急性钝挫伤动物模型，检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62及自噬相关基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1等指标，观察损伤后上述因子的变化情况。研究发现，与正常组比较，损伤后 3 d、5 d、7 d、14 d，atg7，atg12，atg16L1mRNA表达呈现先升高后降低的规律性变化，且变化趋势一致，atg10变化与之正好相反。atg7是具有泛素E1样酶活性的自噬相关基因，已证实Atg7是atg12-atg5泛素样蛋白通路上游的蛋白质分子，在自噬体扩张伸展中具有重要作用［14］。首先水解的Atg7通过自身被激活的507位半胱氨酸残基与Atg12的C末端甘氨酸残基结合形成高能硫酯键，催化Atg12活化，之后转运至具有泛素E2样酶活性的Atg10，再通过与Atg5连接形成异肽键，构成Atg7-Atg5系统，而后再和Atg16L1以共价键结合，组成三元复合物 Atg12-Atg5-Atg16L1［14］，该复合物与前自噬泡外膜结合，促进自噬泡的伸展和延伸。因此，当细胞自噬活性增强时，Atg7、Atg12、Atg16L1表达应明显增多，Atg10应明显减少。结合上述实验结果，不难发现骨骼肌急性钝挫伤后自噬相关基因转录水平发生了改变，改变提示自噬活性明显增强，随着机体损伤的自我修复，自噬活性又逐渐降至损伤前的基础状态，提示自噬相关基因 atg7，atg10，atg12，atg16L1参与损伤的修复，推测肌肉损伤修复的速度很可能与该基因的转录水平高低密切相关。同时，研究表明Atg7也参与LC3-I的活化，促进 LC3-I与PE（phosphatidyl ethanolamine，磷脂酰乙醇胺）结合形成自噬标记分子 LC3-II。LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳动物中Atg8的同源物，它以两种形式存在，即 LC3-I和 LC3-II，LC3-I与 PE结合成为 LC3-II，是 LC3-I的活化形式，LC3-II含量与自噬泡数量的多少成正比，当细胞内 LC3-I向LC3-II转化增加时，细胞自噬水平明显升高。因此，检测细胞内LC3-II含量变化，可以判断自噬水平的高低［15，16］。同样，由原癌基因 c-myc编码的 P62蛋白位于细胞质中，当细胞自噬时，P62与经泛素化的蛋白质结合，再与LC3-II结合形成复合物，并最终在溶酶体酶的作用下不断被降解［15］。换言之，细胞自噬水平升高时P62水平理论上应下降，而自噬活性受抑制时，P62理论上则不断累积。因此，P62同样可作为反映细胞自噬活性高低的标记蛋白质。作者采用Western blot检测损伤后不同时间点腓肠肌中LC3-II和P62水平，发现骨骼肌钝挫伤后在自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d过程中，LC3-II与 P62总体呈现先升高后降低的趋势，其中3 d、5 d、7 d组LC3-II水平较正常组与14 d组明显升高，14 d组恢复至正常水平。同样，与正常组对比，P62在损伤后第3天达到高峰，损伤后第5天表达开始下降，第14天恢复至正常水平，该结果也表明骨骼肌损伤修复过程中自噬活性一开始会明显增强，但随着机体自我修复，自噬活性会逐渐降至损伤前的基础状态。值得注意的是，骨骼肌损伤后LC3-II和P62两者表达并未呈现完全相反的变化，只是出现峰值的时间不一，可能系P62不仅参与细胞自噬过程，同时也参与多种生命过程，例如有研究发现P62参与细胞抗氧化应激反应中的重要通路NRF2-Keap1通路［17］，同时有研究也表明P62的表达与细胞的分化有关［18］。因此需开展进一步实验，并分析P62在骨骼肌损伤中扮演的角色。

综上所述，本实验建立大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型，通过HE染色和透射电镜对损伤后不同时间点的腓肠肌组织进行形态学观察，同时对自噬相关基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1 mRNA表达水平及自噬相关蛋白LC3-II、P62表达水平的变化进行分析。结果直接和间接证实，骨骼肌急性钝挫伤后自噬活性显著提高，而随着损伤的修复，自噬活性又恢复至损伤前水平，提示细胞自噬参与骨骼肌损伤的修复过程，推测损伤修复的速度很可能与上述指标的表达水平密切相关，这为研究不同治疗方法对骨骼肌损伤修复的作用机制提供新思路。

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