基于参数优化的核磁共振定量技术的建立

(首都医科大学中心实验室，北京 100069)

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是具有自旋的原子核在外磁场作用下发生能级分裂，并在一定射频照射的情况下发生跃迁的现象。核磁共振仪在有机化合物的结构鉴定方面发挥着重要的作用。

核磁共振技术除了用于解析化合物的化学结构外，也可作为一种定量分析方法，即定量核磁技术(quantitative NMR，QNMR)。核磁共振定量分析是以药物结构分析为基础的分析方法，是药物定量分析领域的热点和难点。核磁共振定量分析早在上世纪70年代就已提出来，但是由于仪器灵敏度低，测定的重现性差等条件限制，其综合效果并不理想[1]。随着现代超导高分辨磁场的脉冲傅立叶变换核磁共振仪灵敏度、分析速度的不断提高，核磁共振定量分析方法相比于经典的高效液相色谱法、液质联用、气质联用等方法具有其独特的优势[2]：

(1)对样品测试范围很广，为通用型检测手段，对任何含H的样品都可以进行检测；

(2)对样品无破坏性，实验完成后样品可以回收；

(3)实验过程不需要绘制标准曲线；

(4)样品制备简单，仪器检测快速，对于不稳定的化合物尤为适用；

(5)同核/异核二维核磁技术，可以提供化合物的结构信息，可以同时完成化合物的定性与定量分析。

我国已于中国药典2010版二部附录IX中新加入了核磁共振波谱法[3]，核磁共振仪在药物定性领域已得到较为普遍的应用，但是国内在核磁定量技术方面的研究刚刚起步，多偏重于原理及应用[4],关于如何优化仪器参数去获取高精准度定量结果的研究,少见报道。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

500 MHz核磁共振仪(瑞士Bruker)，分析天平(satorius,BS124S)；液相色谱(安捷伦1200)。

1.2 材料与试剂

维生素C标准品(Sigma公司)；维生素C片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号5150619)；内标1,2,4,5-四甲基苯(sigma)；甲醇 (fisher,色谱纯)；氘代DMSO(sigma，0.03%TMS)。

1.3 方法

1.3.1 优化仪器参数的标准品配制

精确称取维生素C对照品0.0221 g，溶于氘代DMSO，加入5mm核磁管中，待其完全溶解，上机测试。

1.3.2 NMR供试品溶液配制

精确称取研磨后的维生素片粉末5份(0.0124 g、0.0208 g、0.0226 g、0.0094 g、0.0134g)，分别加入内标1,2,4,5-四甲基苯(0.0021 g、0.0018 g、0.0028 g、0.0022 g、0.0023g)，溶于5份氘代DMSO，加入5mm核磁管中，超声15分钟，待其完全溶解，上机测试。

1.3.3 HPLC标准品溶液配制

精密称取维生素C对照品0.0204 g，置于25mL容量瓶中，加流动相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀释至刻度，摇匀 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀释至刻度，摇匀，即得标准品溶液(每1mL中含维生素C 32 μg)。

1.3.4 HPLC供试品溶液配制

维生素C片研磨后称取0.0206 g，置于25mL容量瓶中，加流动相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀释至刻度，摇匀 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液(每1mL中含维生素C 32 μg)。

1.3.5 核磁测定条件 ppm已经不允许使用

使用Bruker标准实验参数PROTON，脉冲序列为zg30，谱宽SW 14.6160，中心频率O1P 6.402，测试温度300 K，观察频率500 MHz，脉冲宽度p1 13.42 μs，采样时间AQ 1.58 s，延迟时间d1 1 s，扫描次数ns 32。

1.3.6 液相色谱条件

色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×200mm×5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；柱温：25℃；流速：1mL/min；检测波长：242nm

2 结果与分析

2.1 定量特征峰、定量内标的选择

QNMR所选内标应满足纯度高，能与被测样品溶于同一种溶剂，不与被测样品及溶剂反应，定量峰易于识别并且至少要保证有一组峰与被测物完全分离等要求[5]。因此，本实验选用1,2,4,5-四甲基苯为定量内标，其苯环上的两个质子在化学位移为δ6.87 处有一尖锐单峰，故选定此峰为内标定量特征信号峰。

维生素C为水溶性化合物，具有烯醇式己糖内酯立体结构，在水中易溶解，结构式和1H NMR见图1。

图1 维生素C的结构式和1H NMR谱

1H NMR谱峰归属如下：δ11.09 ppm、δ8.40 ppm分别对应羟基1-H、2-H质子信号，δ5.25 ppm对应于3-H质子信号，4-H质子信号与δ3.36 ppm水峰信号重叠，δ4.75 ppm对应于6-H质子信号，δ3.84 ppm对应于5-H质子信号，δ3.45 ppm对应于7-H质子信号。由图可见，δ4.75 ppm质子信号易于识别，旁边没有别的信号干扰，因此本实验利用该峰的积分值计算维生素C 的含量。

2.2 核磁定量参数优化

本实验主要考察不同脉冲宽度、采样时间、延迟时间、扫描次数[6-8]对实验结果的影响。结果见表1～表4。

表1 不同p1对相对峰面积比的影响

随着p1的增加，样品定量峰与内标定量峰的积分面积比值随之增大，因此本实验选取p1=13.42 μs。

表2 不同AQ对相对峰面积比的影响

随着AQ的增加，发现AQ=1.58s时As/Ar值最大，故本实验选取AQ=1.58 s。

表3 不同d1对相对峰面积比的影响

随着d1的增加，发现d1=1s时As/Ar值最大，故本实验选取d1=1 s。

表4 不同ns对相对峰面积比的影响

随着ns的增加，发现ns>32时As/Ar增加趋势减慢，故本实验选取ns=32。

2.3 1H NMR谱内标法测定维生素C

2.3.1 定量方法

测定前，使用标准管(90% H2O+10 % D2O)对仪器进行3D匀场，使用0.1% EB标准管精确校准探头90°脉冲宽度。测试供试品的1H NMR谱图，所有谱图使用Bruker Topspin软件处理，每个供试品的积分面积取5次积分的平均值。按公式(1)计算供试品中维生素含量[9]。公式用斜体

(1)

公式(1)中，W代表物质的质量；A代表定量峰积分面积；N代表定量峰所包含的质子数；M代表物质分子量；下标u和r分别为分析物和内标物。本实验中Nu=1(Nu代表分析物δ4.75 ppm的积分面积为1)，Nr=2(Nr代表内标物δ6.87ppm的积分面积为2)，Mu=176.13，Mr=134.22。

2.3.2 含量测定

制备含有不同质量药品的待测样品5份，分别测定1H NMR，结果见表5。

由化学位移为δ4.75 ppm处信号峰面积Au计算结果为：5份样品中维生素C的含量分别为81.4%、80.3%、81.4%、81.9%、82.1%，平均含量为81.4%，相对标准偏差RSD=0.86%。

表5 维生素C含量的核磁共振数据

2.4 HPLC测定维生素C

用单点校正法，定量进样，根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测组分的含量，计算得维生素C的含量为79.5%。与核磁共振定量分析法测得的数据基本相符。

3 讨论

由于核磁共振定量分析是以结构分析为基础的分析方法，可以同步完成结构分析、定性分析和定量分析。同时核磁共振定量分析方法还具有简单、准确、专一性高和不破坏样品等优点。

本实验通过优化核磁定量实验中的各个参数，选定实验中的最佳值，得到的定量结果与高效液相色谱定量分析方法的结果相符合。足够的采样时间可以保证自由衰减信号衰减完全，从而提高分辨率。合适的延迟时间可以保证谱图强度不会被饱和，有利于对谱峰进行正确的积分。在仪器测试状态调整到最优时，定量分析结构可以接近高效液相色谱法。

由本实验可知，核磁共振定量分析法操作简便，数据准确，可为后续其它药物定量分析提供参考。

[1] Pauli G F,Jaki B U,Lankin D C.Quantitative1H NMR:development and potential of a method for natural products analysis[J].J Nat Prod,2004,68: 133-149.

[2] Hazekamp A,Choi Y H,Verpoorte R.Quantitative analysis of cannabinoids from Cannabis sativa using1H NMR [J].Chem Pharm Bull,2004,52: 718-721.

[3] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典 [S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录81-83.

[4] Yu X B,Shen W B,Xiang B R.Advances in application of quantitative nuclear magnetic resonance technique in pharma-ceutical field[J].Prog Pharm Sci,2010,34: 17-23.

[5] Hu M,Hu C Q.Determination of drug reference substance content by1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy [J].Chin J Anal Chem,2004,32: 451-455.

[6] Ernst R R.Application of Fourier transform spectroscopy to magnetic resonance [J].Rev Sci Instrum,1966,37: 93-102.

[7] Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR [J].J Pharm Biomed Anal,2005,38: 813-823.

[8] Pauli G F,Jaki B U,Lankin D C.Quantitative1H NMR: development and potential of a method for natural products analysis [J].J Nat Prod,2004,68: 133-149.

[9] Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR [J].J Pharm Biomed Anal,2005,38: 813-823.