温度对乙酰氨基葡萄糖发酵的影响

戴 维，秦宝福，张 锐，谢书琴

(1.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100；2.天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物，以其为基础合成的氨基葡萄糖盐酸盐和硫酸盐对于冶疗关节炎和胃溃疡等疾病有良好的疗效，同时还可以应用于食品，化妆品和饲料添加剂中[1-2]。随着经济的迅速发展及人民生活水平的提高，近10年来全球出货量基本维持在万吨级别以上，具有极大的市场潜力和经济价值。

目前生产乙酰氨基葡萄糖的方法可分为3种：微生物发酵法、甲壳素水解法和生物转化法[3]。制备氨基葡萄糖的传统方法使用的原料是甲壳素，甲壳素是一种自然界大量存在的再生的天然生物高分子聚合物，广泛存在于低等植物菌类、虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳、真菌的细胞壁等。有文献表明，有些患者对虾蟹等海产品存在过敏反应，对使用此类原材料制成的药物也会过敏[4]。此外，传统方法的原料来源(如虾蟹壳)易受到重金属等有害物质的污染，进而影响产品质量。与传统制备方法相比，发酵法制备氨基葡萄糖的产品来源于微生物，消费者服用后不会发生过敏反应，且发酵原材料不受季节及地域条件的限制，生产周期短、强度高，对环境污染相对较小，生产潜力巨大。

利用重组基因大肠杆菌进行发酵生产以得到乙酰氨基葡萄糖，具有生产稳定性好，且改造后加有抗生素抗性标记，菌种不易退化，改造后的菌种生产氨基葡萄糖能力较强。试验过程中，发现发酵前期溶解氧含量与工艺要求差距较大，同时在发酵中期，残糖及谷氨酸积累，抑制发酵单位的增长。因现有设备的局限性，无法满足发酵过程中溶解氧的需求，而导致菌体大量死亡；为弥补设备不足，通过对发酵过程中控制工艺进行调整，以减缓菌体的死亡及残糖和谷氨酸的积累。因此我们尝试通过适当降低温度达到减缓菌体的生长速率、减少氧的消耗量从而增加溶氧量[5-6]，同时缓解低溶氧水平下残糖和谷氨酸积累对生产菌产物合成造成的不利影响。本文旨在考察在乙酰氨基葡萄糖发酵过程的不同阶段，采用不同培养温度对菌体生长的影响，以此确立乙酰氨基葡萄糖不同阶段的最佳培养温度，最终采用变温培养的方法提高乙酰氨基葡萄中试发酵试验的生产水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Dg021(天方药业有限公司提供)。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：磷酸二氢钾10，磷酸氢二钾8，硫酸镁0.3，七水合硫酸亚铁0.005，七水合硫酸锌0.005，一水合硫酸锰0.003，五水合硫酸铜0.003，二水合柠檬酸三钠2，二水合氯化钙0.15，泡敌0.15。

发酵培养基(g/L)：磷酸二氢钾10，磷酸氢二钾15，硫酸镁3，七水合硫酸亚铁0.05，七水合硫酸锌0.05，一水合硫酸锰0.03，五水合硫酸铜0.03，一水合柠檬酸2，二水合氯化钙1.5，泡敌0.15。

1.2 培养方法

1.2.1 种子罐

36.5±1℃培养，罐压0.03MPa，风量1∶1，接种后全程开启搅拌。

1.2.2 发酵罐

36.5±1℃培养，罐压0.03MPa，起始风量1∶1，接种后全程开启搅拌，发酵过程中根据溶氧情况调整搅拌转速。

1.3 检测手段

1.3.1 乙酰氨基葡萄糖含量测定

HPLC法[7]。

1.3.2 氨基氮的检测

甲醛滴定法[8]。

1.3.3 OD600 测定

OD值在0.3～0.7取发酵液直接在分光光度计600nm处，纯水做对照对数即OD值；OD值1以上根据浓度稀释，确保吸光值落在0.3～0.7之间，600nm读数，数值乘以稀释倍数即OD值。

1.3.4 发酵液中葡萄糖及谷氨酸检测

SBA-生物传感分析仪，标准液标定，待路灯显示进样，取发酵液20000r/min离心2min上清液25μL，进样，直接读出葡萄糖与谷氨酸的浓度；如果数值超过100则需稀释。

2 结果与讨论

在氨基葡萄糖的发酵中，原有的工艺温度控制范围为36.5±1℃，发酵9小时左右OD值为23～30时添加诱导剂。试验采用了逐步降温的方法来考察温度对氨糖发酵的影响，共进行了五个梯度的试验，如表1所示。

表1 各组中试发酵试验的培养温度Table 1 The culture temperature of the pilot fermentation test in each group

2.1 降温对各项指标的影响

发酵19h 、36.5±1℃培养，19h后36±1℃培养(对照)与诱导前36.5±1℃，诱导后36±1℃，23h 35±1℃培养(试验1)对氨糖发酵各项指标的影响，如表2所示。

表2 降温培养后对照与试验1各项指标的对比Table 2 Comparison of Control and Test 1 Indicators after Cooling Culture

在氨糖发酵的工艺控制中，残糖和谷氨酸分别达到10 mg/100mL以上即超过工艺要求值，残糖和谷氨酸大量积累后会影响氨糖单位的增长。从表2中可以看出降温前，发酵罐30h以后谷氨酸开始积累，47h残糖积累，此时单位增长停滞，至54h单位倒长；诱导后降温培养发酵罐在41h谷氨酸开始积累，54h残糖出现积累现象，单位增长较对照组有明显好转。我们可以看出在氨糖发酵中采用降温培养对单位的提高有明显的改善，因此在试验中继续降低发酵过程中的温度。

2.2 谷氨酸的变化趋势

诱导前36.5±1℃，诱导后35±1℃培养(试验2)与诱导前35±1℃，诱导后34±1℃培养(试验3)。在试验2和试验3中残糖均未积累，其谷氨酸浓度对比见图1，单位指标对比见图2。

图1 试验2和试验3谷氨酸浓度对比

图2 试验2和试验3单位指标对比

由图1及表2可以看出试验2，试验3同试验1相比谷氨酸浓度要低，试验3在整个发酵过程中谷氨酸未发生积累现象；从整个发酵过程中的单位增长趋势来看试验2和试验3也较试验1要高。由图2可以看出虽然试验3相较试验2起步单位要低但是在发酵后期试验2出现倒长现象，而试验3一直保持着稳定的增长。从试验1到试验3我们可以看出在中试试验中较低的培养温度对氨基葡萄糖发酵单位的增长有积极的作用，因此再接下来的实验中继续进行低温试验。

2.3 诱导前后温度变化对各项指标的影响

移种后整个发酵过程中33±1℃培养(试验4)与诱导前36.5±1℃，诱导后33±1℃培养(试验5)。

表3 试验4和试验5的各项指标对比

由表3可以看出试验4和试验5谷氨酸和残糖全程基本无积累，且整个发酵过程中单位一直在稳定增长。最终放罐单位相比前三个试验要高出18%以上。但是试验4由于发酵全程一直是33±1℃培养，菌体生长较慢造成诱导时间比试验5晚两个小时以上，且起步单位要低。试验5诱导后33±1℃培养，残糖及谷氨酸没有发生积累，其最终放罐单位比试验4高。因此在以后的中试试验中我们确立了诱导前36.5±1℃，诱导后33±1℃培养的工艺路线。

3 结论

在我们进行氨糖中试发酵试验过程中，由于现有的中试设备限制溶氧条件不能满足氨糖发酵过程中菌体的生长，我们通过更改补糖计量罐，调整搅拌装置，提高通风量等一系列措施下仍不能满足菌体对溶氧的需求，于是我们采用降低培养温度来增加发酵过程中的溶解氧。经过大量的试验，我们发现不但发酵溶氧水平相较以前有了明显改善，残糖和谷氨酸积累现象也得到了改善，氨糖发酵单位由最初的20 g/L左右提高到最高90g/L，并在之后的试验中平均单位稳定在75 g/L左右。出现这种情况的原因是，通过降低温培养度，减缓了菌体的生长速率、减少了氧的消耗，从而使溶氧达到工艺要求值。另一原因是氨糖发酵使用的是较稀薄的培养基，在较低的培养温度下，菌体生长放缓，营养物质代谢减慢，利于延长发酵周期，提高产量。最终我们确定了诱导前36.5±1℃，诱导后33±1℃培养的工艺路线，虽然此工艺路线是在设备受限的情况下得出，但是我们在试验中发现降温培养对氨糖发酵过程中抑制谷氨酸、残糖的积累以及延长发酵周期从而提高铵糖产量有明显作用，这对于今后氨糖大规模生产中的工艺控制有很强的指导意义。

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