MIR-92a、MIR-100及MIR-143在膀胱癌患者血清的表达及临床意义

史金虎，王 刚，郭留雄，李守宾，孙福振，杨 涛，姜崇浩，周天宝，罗庆先，刘俊江

(1.河北省人民医院泌尿外科，河北石家庄 050002;2.河北北方学院研究生院，河北张家口 075002)

膀胱肿瘤是临床上常见的泌尿外科疾病[1]，在美国其发病率位居男性肿瘤第2位，仅次于前列腺癌，在我国居第一位且大部分属于表浅性膀胱肿瘤，占60%[2]。目前全世界范围内每年新发膀胱癌患者病例超过30余万例，位列人体常见肿瘤发病率的第7位，肿瘤死亡率排在第8位，严重威胁着人类的健康与生命安全[3]。近年来肿瘤标记物诊断因其敏感性较高，在临床中应用越来越广泛，其中肿瘤标记物主要关注的焦点在MIRNA上。

目前世界上多个研究中心的研究结果表明，MIRNA可以作为潜在的肿瘤标记物，MIRNA是一种非编码类RNA，由内源性的大小19～23个碱基的单链非编码的小分子RNA，其主要通过与mRNA 互补结合并参与基因调控表达，调节其翻译和稳定性，发挥着转录后调节的作用[4]。MIRNA可以调节许多蛋白的编码的基因，抑制蛋白的合成或者促进蛋白的合成，调节细胞的分化、发育、凋亡等转录过程中的基因表达水平，这表明了它既可以诱导癌基因的表达促进肿瘤形成，同时又可以抑制癌基因的表达，减缓肿瘤的形成或避免肿瘤形成，这些方面都表明MIRNA与肿瘤有一定的关系[5-6]。

本研究旨在通过检测膀胱癌患者和健康受试者血清样本中的MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相对表达水平，分析其表达水平以及探讨其对膀胱癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料本研究通过收集河北省人民医院2016年10月至2017年4月期间，50例临床及病理诊断为膀胱癌的患者为观察者，其中男35例，女15例，平均年龄(54.8±5.46)岁，所有的膀胱癌患者根据活检或术后病理类型分为非浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)组[平均年龄(56.3±10.8)岁]和浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)组[平均年龄(53.7±6.6)岁]。对照组为50例同期体检正常的健康人群，其中男38例，女12例，平均年龄(55.6±8.9)岁。观察者纳入标准：①临床资料完善；②存在病理诊断。排除标准：①长期慢性或复发性泌尿系感染者或血尿者；②肝肾功能严重不全者；③存在其他部位的实性肿瘤或恶性血液性疾病；④接受过放射线、化学治疗、生物靶向治疗、中药治疗者。对照组排除标准：①急性泌尿系感染者或尿出血者；②存在家族性遗传性恶性肿瘤者；③近期应用过免疫抑制剂或大量激素者。对照组与观察组的一般临床资料(性别比例、平均年龄)差异无统计学意义。本研究的病理分期采用2002年国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)发表的第6版TNM分期[7]法进行分期，组织学分级采用2004年WHO发表的分级法进行分级。河北省人民医院伦理委员会审议通过了本次研究过程。所有的受试者入组之前均向患者及其家属详细交代了试验目的，并签署知情同意书。

1.2试剂与仪器血清总RNA提取试剂盒，MIRNA逆转录试剂盒和MIRNA SYBR Green PCR试剂盒均购自TaKaRa 公司；PCR仪器(聚合酶链反应仪器)(型号9700)及实时荧光定量PCR仪(StepOne TM)均购自美国ABI公司，Trizol试剂购自上海慧颖生物科技有限公司，MIR-92a、MIR-100及MIR-143特异性反转录引物与实时定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-qPCR)特异性扩增引物购自南通百奥迈科公司。微量紫外可见分光光度计(K5600)购自北京凯奥科技发展有限公司。

1.3标本的采集及制备从膀胱癌患者或健康受试人群的肘正中静脉抽取10 mL血，存放入含有乙二胺四乙酸二钠的试管中，随后将其置于离心机中，离心3 000 r/min，4 ℃，离心10 min，然后再置入离心机中，5 000 r/min，4 ℃，离心5 min。离心结束后，将离心管常规喷洒酒精消毒后置于安全柜内，去除上清，加入1 mL含10%FBS的培养基并吹打混匀形成细胞悬液，将细胞悬液吸入冻存管，再加入 350 μL上述培养基，4 ℃预冷15 min；其后加入150 μL DMSO，轻轻吹打混合均匀，标记细胞种类及冻存日期，封口膜封口，放入冻存盒内置于-80 ℃冰箱过夜，次日再移入液氮罐内保存备用。我们只选用非溶解性红细胞的血液样本，因为溶解性的红细胞容易影响MIRNA的水平。溶解性的红细胞通过541 nm的光谱探测检出。

1.4提取检测MIRNA取出提取的细胞(拧紧)，立即放入37.0 ℃的水浴箱中，90 s从中取200 μL样本，利用血清总RNA提取试剂盒提取总RNA，并用提取的MIRNA取5 μL利用MIRNA反转录试剂盒进行反转录。反应的条件为：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。当MIRNA反转录完成后，取5 μL利用RT-qPCR将其进行扩增。取25 μL样本液应用SYBR Green PCR试剂盒将放入周围温度为95 ℃的环境中15 min，接着放入94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s进行40个循环，然后在70 ℃环境中进行MIRNA 实时定量 PCR 检测。以U6作为内参，根据系统生成的样本拷贝数，采用定量PCR中的相对定量法检测MIR-92a、MIR-100及MIR-143的表达水平。MIRNA的表达水平用△循环阈值(△Ct)表示，△Ct=Ct(MIR-92a、MIR-100及MIR-143)-Ct(U6)。上述所有操作均按照试剂盒说明书进行操作，并且重复操作3次，取其平均值。MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相对表达水平用2-△Ct计算法计算。

2 结 果

2.1MIRNA的相对表达水平如表1所示，膀胱癌患者的血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相对表达水平相对于健康人群组(50人)明显降低，而且MIR-143的相对表达水平在MINC(35人)与NMIBC(15人)中有显著的不同，各组数据均有统计学意义(P<0.05)。

表1各组MIRNA的相对表达水平比较

组别例数MIR-92aMIR-100MIR-143NMIBC150.537±0.2100.340±0.154 0.592±0.094MIBC350.522±0.1790.294±0.248 0.293±0.171健康人群500.956±0.2680.795±0.364 0.671±0.090 2F值12.34128.8065.916P值0.0010.0000.017

2.2血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相对表达水平对膀胱癌的诊断价值本研究通过分别分析单个检测MIRNA的表达以及两者组合及三者组合联合检测分析MIRNA的表达对膀胱癌的诊断价值。MIR-92a、MIR-100及MIR-143的临界值分别为0.590、0.654、0.380。曲面下面积及灵敏度、特异度如图1所示：

A：MIR-92a；B：MIR-100;C：MIR-143;D：MIR-92a，MIR-100;E:MIR-92a，MIR-143;F：MIR-100，MIR-143;G:MIR-92a，MIR-100及MIR-143。

图1血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的ROC曲线及灵敏度、特异度

3 讨 论

膀胱肿瘤是泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤之一，治疗后复发率较高,因此早期发现、早期治疗就显得尤为重要。MIRNA不仅可作为一种潜在的肿瘤诊断标记物，而且对其预后的评判也可以作为参考物。目前已有多种膀胱癌肿瘤标记物被报道可用于膀胱癌诊断或监测，但尚无实际临床应用[8]。有研究报道指出，人类大约有50%的癌症与MIRNA有关[9]。2007年全球第1例报道膀胱癌中MIRNA表达改变的文章在Urol Oncol[10]上被发表，此后，关于MIRNA在膀胱癌发生发展中的作用成为研究热点。夏伟、宋涛等[11]利用MIRNA芯片技术发现了在膀胱癌组织中145种MIRNA有统计学意义的差异变化，其中下调的有42种，包括MIR-143、MIR-145、MIR-99a等，上调的有73种，包括MIR-708、MIR-182等。WANG S等[12]、NOGUCHI等[13-15]及ADAM等[16]发现膀胱癌患者的MIR-100、MIR-143/145及MIR-92a显著低表达。在我们的研究中，用样本MIRNA的相对表达水平作为标记物去检测膀胱癌患者。在实验中我们选取了3种MIRNA(MIR-92a，MIR-100及MIR-143)已经在国外杂志中发表并证实它们在膀胱癌组织细胞中的表达水平下降，可作为潜在标记物。本研究通过检测血清样本中3种MIRNA的相对表达水平来确定其是否可以作为肿瘤潜在标记物。

在本研究中，膀胱癌患者中3种MIRNAs的表达水平与健康人群比较明显降低，而且血清中MIR-143的相对表达水平可以作为膀胱癌患者中区别MINC与NMIBC的初步诊断指标(P<0.05)。通过本实验可以看出MIR-92a、MIR-100及MIR-143可以作为初步诊断膀胱癌的潜在标记物。

我们应用ROC曲线分析了单独的MIR-92a、MIR-100、MIR-143以及两者或三者组合联合检测对膀胱癌的诊断价值。根据结果显示两者组合中MIR-92a与MIR-143组合的灵敏度及特异度最高，与三者组合相比MIR-92a与MIR-143组合无明显差异，这提示我们MIR-92a与MIR-143组合在诊断膀胱癌中具有较好的诊断价值，可以作为血清检测膀胱癌的潜在标记物。

但是本实验还存在一定的缺陷:第一，样本较小，未来可以通过大样本进一步确认;第二，所有血清MIRNAs的样本均为我国患者，其是否适用于全球其他地区还需进一步证实。

综上所述，本研究结果表明，膀胱癌患者血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143相对表达水平明显降低，MIR-92a与MIR-143组合联合检测其表达水平可以更好地诊断膀胱癌。

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