马氏珠母贝GAPDH基因克隆及其在去甲基化受精卵中的表达分析

李耀国， 孙 彤， 武文丽， 陈永志， 蒋丹尼

(海南热带海洋学院生命科学与生态学院，海南三亚 572022)

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，是参与糖酵解等能量代谢反应中的关键酶，还具有修复DNA、调节组蛋白、促进细胞凋亡等一系列功能，是一种参与多种亚细胞水平活动的多功能蛋白质[1]。GAPDH广泛存在于众多生物体中，在细胞中含量占总蛋白质的10%～20%；种属间序列高度保守，因在同种细胞或不同组织中蛋白质表达量相对恒定而常作为管家基因[2]。其分子一般为4个相同亚基构成的四聚体，每个亚基含催化结构域和辅酶结合结构域[3]。水产动物中已有GAPDH基因的cDNA全长序列克隆及相关研究。如半滑舌鳎GAPDH基因的开放阅读框全长序列为1 002 bp，编码333个氨基酸的多肽链[4]。外因刺激可以改变GAPDH的表达水平，雌性食蚊鱼暴露在不同浓度双氯芬酸钠后肝脏GAPDH的表达量出现显著变化[5]。

DNA链上存在一种甲基化修饰，被视为基因表达的“沉默标记”，它可通过甲基基团的空间位阻效应或促使阻抑蛋白与甲基化DNA相结合而抑制基因表达[6]。去甲基化试剂5-氮杂胞苷能整合到DNA链中，抑制甲基化转移酶的活性使基因或基因组去甲基化，进而调节基因的表达[7-8]。

马氏珠母贝(Pinctadafucata)是中国南部沿海广泛分布的一种珍珠贝。目前，尚未见马氏珠母贝GAPDH基因全长cDNA序列的相关报道。本研究对马氏珠母贝GAPDH基因的全长cDNA进行了克隆及生物信息学分析，并探索了去甲基化试剂对受精卵中GAPDH基因表达水平的影响，以期为后续GAPDH的功能研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验用马氏珠母贝采集自中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站(深圳)，于实验基地海水池中暂养1周。取健康马氏珠母贝外套膜组织，迅速转移至-80 ℃液氮罐中保存待用。此外，设立3组马氏珠母贝雌、雄亲本单对配对的人工授精试验。分别将每组单对配对亲本产生的精子和卵细胞混合形成受精卵，并将每组分成两大部分，对照组采用灭菌海水处理10 min，试验组用10-5mol/L 5-氮杂胞苷溶液处理 10 min。处理后分别采集各组受精卵样品于液氮保存待用。

1.2 核酸提取及cDNA模板合成

样品总RNA的提取按照广州美基公司的核酸提取试剂盒说明书操作，提取后的RNA稀释于超纯水中，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计D260 nm/D280 nm值分析核酸的完整性和测定核酸浓度。RACE试验所用cDNA模板合成按SMARTerTMRACE(rapid amplification of cDNA ends)cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)说明书进行。荧光定量PCR检测所用cDNA模板按照ReverTra Ace-first-strand cDNA synthesis kit(TOYOBO，Japan)试剂盒说明书进行合成。

1.3 GAPDH cDNA全长序列克隆

基于转录组测序所得马氏珠母贝对应GAPDH基因的Unigene序列(603 bp)，应用Primer Premier 5.0软件设计RACE PCR所需正、反向引物，引物由华大基因广州分公司合成。引物分别为5′ 端RACE外引物GARA5-1和5′ 端内引物GARA5-2；3′ 端RACE外引物GARA3-1和3′ 端内引物GARA3-2。RACE PCR外扩增的反应体系为25 μL，包含：12.5 μL Premix ExTaq(TaKaRa，大连)，1 μL cDNA模板，1 μL 10 pmol/L 基因5′端或3′端外引物，1 μL 10 pmol/L的UPM mix引物(由UPM long和UPM short引物混合配制而成)，加ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：94 ℃ 5 min；5个循环的94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15个循环的94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15个循环的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；最后在72 ℃下延伸5 min。将第一轮RACE外扩增PCR产物稀释30倍作为第二轮内扩增PCR反应的模板，内扩增PCR体积为25 μL ∶12.5 μL Premix ExTaq，1 μL稀释的产物模板，1 μL对应的 5′ 端或3′ 端10 pmol/L内引物，1 μL 10 pmol/L NUP引物，加ddH2O 9.5 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；35个循环的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；72 ℃下延伸5 min。取5 μL PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切取单一条带，胶纯化，送华大基因广州分公司转菌落测序。

1.4 序列分析

通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast程序进行2个序列比对分析，将获得的5′端或3′端cDNA序列以及转录组GAPDH对应Unigene序列进行拼接得到GAPDH基因全长cDNA序列。GAPDH基因的开放阅读框预测由NCBI中在线软件ORF Finder分析完成。利用ProtParam软件分析该基因的蛋白质分子量、理论等电点等信息。SignalP-4.1 server http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测GAPDH蛋白的信号肽序列。在线软件TMHMM Server 2.0预测跨膜结构，PSORT Prediction软件预测亚细胞定位点。蛋白质的三级结构由Swiss-Model在线服务器(http：//swissmodel.expasy.org/)进行预测。GAPDH蛋白质的氨基酸残基序列同源性比对由ClustalW1.83软件完成，利用MEGA 5.0软件共同完成系统进化树的构建(采用邻接法，并设置Bootstrap值为1 000)。

1.5 荧光定量分析

基于获得的GAPDHcDNA全长序列设计荧光定量PCR引物GAPDHF和GAPDHR进行基因表达量检测。对马氏珠母贝3个单对配对亲本产生的对照组和试验组受精卵样品中GAPDH的表达量进行检测，选用的内参基因为马氏珠母贝18S(GenBank登录号：AY028625.1，引物为18S F和18S R)。荧光定量PCR反应在Roche LightCycler480仪器中进行。反应体系如下：5 μL 2×SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)，1 μL模板cDNA，荧光定量引物各0.4 μL(10 μmol/L)，加3.2 μL去离子水使总体积为10 μL。反应条件为：95 ℃ 1 min；45个循环的95 ℃ 5 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s。PCR产物特异性根据溶解曲线作出判断，基因的相对表达量通过Ct方法计算。利用SPSS 19.0软件卡方检验比较组间GAPDH基因表达水平差异，显著性水平设置为P<0.05，本试验中所有引物序列见表1。

表1 GAPDH基因cDNA克隆及荧光定量表达引物

2 结果与分析

2.1 GAPDH基因cDNA全长序列的获得

基于马氏珠母贝转录组测序所得GAPDHUnigene序列进行RACE PCR。扩增得到了长度为281 bp的5′端和 1 088 bp 的3′端产物(图1)。拼接5′末端序列、3′末端序列和Unigene序列得到了全长为1 174 bp的GAPDH基因cDNA序列。该cDNA序列的ORF长度为1 014 bp，编码337个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。序列的5′端存在38 bp的非翻译区，3′端存在122 bp的非翻译区(图2)。

2.2 GAPDH基因编码蛋白质特征分析

对GAPDH基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析，结果显示其所编码蛋白质的原子总数为5 068，蛋白质分子量为36.04 ku，理论等电点为7.66，不稳定系数值为 23.89，属于稳定蛋白。该蛋白序列经预测不具有信号肽，无跨膜结构域。GAPDH蛋白质的亚细胞定位分析显示该蛋白分布在细胞质中的可能性最大(69.6%)。该蛋白具有1个甘油醛-3-磷酸脱氢酶NAD结合域以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶C末端结构域。用SWISS-MODEL在线分析对马氏珠母贝GAPDH编码蛋白的三级结构进行了建模预测，结果如图3所示(模型为马来丝虫的GAPDH蛋白，SMTL id：4k9d.1)。

2.3 GAPDH基因序列比对与系统树分析

用ClustalW1.83软件将马氏珠母贝GAPDH氨基酸序列与章鱼(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)、 厚壳玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus，BAF43305.1)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes，NP_001267044.1)、孔雀鱼(Poeciliareticulata，XP_008429670.1)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus，XP_005455495.1)、尖吻鲈(Latescalcarifer，XP_018538252.1)、丝虫(Loaloa，EJD75047.1)、布氏鼠耳蝠(Myotisbrandtii，XP_005873775.1)、橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster，XP_005365298.1)、灰地鼠(Cricetulusgriseus，NP_001231783.1 )、密西西比短吻鳄(Alligatormississippiensis，XP_006258426.1)、中华鳖(Pelodiscussinensis，NP_001273856.1)、绿海龟(Cheloniamydas，ALU11325.1)、东部乌梢蛇(Thamnophissirtalis，XP_013923068.1)、新疆北鲵(Ranodonsibiricus，AMA21735.1)、眼斑雀鳝(Lepisosteusoculatus，XP_006642411.1)和小孢根霉(Rhizopusmicrosporus，CEG72784.1)的GAPDH氨基酸序列进行多重比较，发现共有177个氨基酸残基位点为完全保守位点(图4)。对上述物种的GAPDH进行系统发育树的构建，发现马氏珠母贝GAPDH蛋白首先与软体动物门的厚壳玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)进行聚类，然后与同是软体动物门的章鱼(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)进行聚类，进化树亲缘关系与动物分类学地位一致(图5)。

2.4 去甲基化试剂处理受精卵中GAPDH表达检测

荧光定量PCR检测显示，经去甲基化试剂5-氮杂胞苷溶液处理后，GAPDH基因在马氏珠母贝受精卵中的表达水平上升，其表达量显著高于对照组(灭菌海水处理)受精卵样品中的表达量(P<0.05)(图6)。

3 结论与讨论

本研究通过RACE技术克隆获得了马氏珠母贝GAPDH基因cDNA全长序列(GenBank登录号：KX129947.1)。该基因全长1 174 bp，其开放阅读框长度为1 014 bp，编码337个氨基酸，蛋白质分子量为36.04 ku，该蛋白具甘油醛-3-磷酸脱氢酶NAD结构域和甘油醛-3-磷酸脱氢酶C末端结构域。在糖酵解过程中，这2个结构域可结合3-磷酸甘油醛和NAD+，催化3-磷酸甘油醛转变为1，3-二磷酸甘油酸，并以NAD+为受氢体生成NADH[3]。GAPDH蛋白的氨基酸序列在物种间保守性高，该研究比对物种中共有177个氨基酸残基位点为完全保守位点。马氏珠母贝GAPDH蛋白与同属软体动物门的厚壳玉黍螺和章鱼的亲缘关系相近，这与它们均为软体动物的分类学地位一致。

定量检测基因表达时，目的基因的表达量需与参考基因表达量进行标准化处理，GAPDH基因常被用作参考基因。如GAPDH基因在家蝇的不同发育时期及组织和不同饲养条件下表达稳定，可作为基因定量表达检测的内参基因[9]。理想的内参基因应在各类型细胞、不同组织及不同处理条件下均表达量恒定，而研究发现大多常用的内参基因表达并不稳定，会影响到实时荧光定量PCR实验的准确性[10-11]。GAPDH基因在严重败血症病人血液中的表达量较正常人中的表达量显著升高[12]。利用3种软件分析蓝点马鲛鱼候选内参基因EF-1α、18S rRNA和GAPDH在不同组织中的表达稳定性，结果显示GAPDH表达量是最不稳定的[13]。应用实时荧光定量PCR检测了马氏珠母贝GAPDH、β-肌动蛋白和18S rRNA共3个基因在不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期的表达水平。结果显示，β-肌动蛋白表达量最稳定，18S核糖体RNA在性腺发育阶段表达最稳定，而GAPDH基因在3个试验组中均显示为稳定性最差[14]。

基因核苷酸序列变异及其上的表观遗传修饰均可引起基因表达量的变化。笔者前期研究发现马氏珠母贝外套膜基因组DNA甲基化水平与galectin基因的表达水平呈负相关，而galectin启动子区甲基化水平与基因表达水平呈显著正相关，DNA甲基化可能对galectin基因的表达具调控作用[15]。本研究中发现马氏珠母贝受精卵经去甲基化试剂5-氮杂胞苷处理后，GAPDH基因表达水平较对照组显著上升(P<0.05)。据此可推测，马氏珠母贝GAPDH基因表达升高可能是去甲基化修饰所致，而其不适合作为内参基因的可能原因是不同条件下基因甲基化修饰变化所引起的基因表达水平变化。

本研究获得了马氏珠母贝GAPDH基因的全长cDNA序列，并利用去甲基化试剂(5-氮杂胞苷)处理受精卵，结果发现GAPDH基因表达量显著升高。本研究结果为今后GAPDH基因的功能研究及表达调控机制分析提供了基础及思路。

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