黑曲霉产α-葡萄糖转苷酶发酵条件的研究

◎ 林晓华

（安徽粮食工程职业学院，安徽 合肥 230013）

α-葡萄糖转苷酶主要是由黑曲霉（Aspergillus niger）发酵生产，目前已广泛应用于基础开发研究领域，主要包括生产低聚异麦芽糖[1-5]、淀粉水解[6]、酒精发酵、代谢机理研究、食品成分分析和医学诊断[7-8]等方面。但目前国内生产α-葡萄转糖苷酶酶制剂厂家较少，其发酵周期较长，所耗的培养基量较多，酶的产量和特性不易控制，因此对于α-葡萄糖转苷酶生产成本的控制是各酶制剂厂家急需解决的问题。啤酒废酵母是啤酒工业的主要副产物之一。生产100 t啤酒可产1～1.5 t的啤酒废酵母（以干重计），啤酒废酵母若直接排弃，必将产生环境污染，同时给企业造成经济损失[9-10]。因此，利用啤酒废酵母开发高附加值产品已经被啤酒同行所关注。

鉴于此，本文以啤酒酵母自溶物替代微生物发酵培养基中的酵母浸膏，研究其对黑曲霉发酵产酶的影响，为啤酒废酵母的综合利用提供更为直接和廉价的方法打下良好的理论基础，在此基础上对黑曲霉发酵产酶条件进行优化，得出最佳的α-葡萄糖转苷酶发酵工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉（Aspergillus niger）菌种、乙酸、乙酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氢钠、盐酸、4-氨基安替比林、苯酚、α-甲基葡萄糖。

1.2 仪器与设备

天平、可见分光光度计、灭菌锅、水浴锅、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台等。

1.3 方法

（1）培养基。①菌种斜面培养基：察氏培养基。②种子及发酵培养基：葡萄糖40～50 g/L、酵母膏18 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、尿素2 g/L，pH 5.5～6.0，根据不同的实验设计要求，改变培养基的各组分。③酵母自溶物的制备：取啤酒废酵母按质量比1∶1加水稀释后，添加3% NaCl，调pH至6.5，50 ℃条件下自溶48 h，取出后至沸水浴中灭酶10 min，冰箱冷藏保存待用。

（2）接种及培养。斜面培养基接种后至于30 ℃培养箱恒温培养3 d，取10 mL无菌水用接种环刮取斜面菌落摇匀后取2.5 mL接种至装有25 mL培养基的小摇瓶（250 mL）作为一级种子，200 r/min，30 ℃条件下摇床培养48 h后，按10%接种量接种到发酵摇瓶，在温度为30 ℃，发酵初始 pH 5.5～6.0，摇床转速为200 r/min条件下发酵110～120 h取样测定。

（3）酶活检测[11]。参考QB 2525-2001《食品添加剂α-葡萄糖转苷酶》的方法进行酶活的测定。

1.4 试验设计

以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作为发酵培养基，根据单因素试验确定酵母自溶物的最适添加量。并在此基础上对黑曲霉培养条件进一步优化。通过Design-Expert 7.1（Stat-Ease,Inc.）对实验所得数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 酵母自溶物添加量对黑曲霉发酵产α-葡萄糖转苷酶的影响

发酵培养基按葡萄糖40～50 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，尿素2 g/L，酵母自溶物作为氮源分别添加80、100、120、140 mL/L和160 mL/L，pH 5.5～6.0，灭菌后接种黑曲霉菌种子培养基，200 r/min，30 ℃恒温培养120 h后，取发酵上清液测定α-葡萄糖转苷酶活力。同时作对照试验，结果如图1所示。

图1 酵母自溶物的添加量对产酶的影响图

由试验可知，在酵母自溶物添加量为120 mL/L时，α-葡萄糖转苷酶可以达到最大值175 U/mL，而添加酵母膏的对照组在相同培养条件下发酵所得酶活力为165 U/mL，由此可知，以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作为N源是可行的，经过与原培养基成本对比，可以减少5%的培养基成本。

2.2 培养条件对黑曲霉发酵产α-葡萄糖转苷酶的单因素试验

以α-葡萄糖转苷酶为指标，分别研究了发酵温度、发酵时间、发酵初始pH和搅拌速度对黑曲霉发酵产酶的影响，结果如图2所示。

根据上述单因素试验的结果，对发酵时间、发酵初始pH、搅拌速度和发酵温度进行4因素3水平的试验，每组2个重复。正交设计表格见表1。

表1 正交试验因素水平表

发酵条件对α-葡萄糖转苷酶产量的正交试验结果如表2所示，由正交试验结果可知，各因素影响α-葡萄糖转苷酶产量的顺序为B＞A＞D＞C，即发酵初始pH是影响α-葡萄糖转苷酶活力的主要因素，其次是发酵时间，然后是发酵温度、搅拌速度，最适发酵条件为A2B2C2D1，即在发酵初始pH为6.5，发酵温度30 ℃，搅拌速度为200 r/min，发酵120 h所得的α-葡萄糖转苷酶活力最高。通过对最佳发酵条件的组合进行5次验证性试验，测得α-葡萄糖转苷酶活力的平均值可以达到200 U/mL。

表2 α-葡萄糖转苷酶产量的正交试验结果表

3 结论

文章通过对黑曲霉发酵产α-葡萄糖转苷酶的条件进行了优化，选用了自制的啤酒酵母自溶物替代了商业酵母膏作为氮源，在此基础上对α-葡萄糖转苷酶的发酵温度，发酵时间，搅拌速度和初始pH等发酵条件进行了优化，得出了最佳的发酵工艺，降低了α-葡萄糖转苷酶的培养基成本，提高了产量。

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[11]中国轻工业联合会.QB 2525-2001 食品添加剂α-葡萄糖转苷酶[S].北京：中国轻工业出版社，2002.