HPLC测定可溶微针贴片中熊果苷的含量

胡 霞,陈明龙,杨伟汉,马 涛,王清清

(蚌埠医学院药学院药剂学教研室,蚌埠 233000;*通讯作者,E-mail:candywqq@163.com)

近年来,可溶微针贴片作为一种新型经皮给药剂型已经受到越来越多的关注,它是由水溶性材料和药物混合制成[1-3],可溶微针材料一般为可溶性聚合物、蛋白或糖类,施用后,插入皮肤内的微针在少量组织液中迅速溶解从而释放药物。目前可溶微针贴片研究多集中在大分子药物方面,如蛋白、DNA等[4,5],对美白小分子药物的相关研究鲜有报道。本课题组以透明质酸(hyaluronic acid,HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K90)作为制针材料,熊果(arbutin)苷作为美白小分子模型药物,应用两步注模干燥法制备出可溶微针贴片[6]。

HPLC已被广泛用于各种定量分析研究[7,8],但关于可溶微针贴片中药物含量测定的相关研究少有报道。本实验采用HPLC法对可溶微针贴片中熊果苷进行含量测定以及方法学验证。旨在建立一种准确可行的可溶微针贴片中熊果苷的含量分析方法,为该种新型给药制剂的质量研究提供一定的理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(LC-15C,日本岛津);双光束紫外可见分光光度计(TU-1901,北京普析通用仪器有限责任公司);超声波清洗器(KQ5200B,昆山市超声仪器有限公司);十万分之一电子分析天平(XP 205型,梅特勒-托利多公司);纯水仪(Advantage A10,Milli-Q公司)。

1.2 试药

可溶微针贴片(本课题组自制);熊果苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111951-201301,纯度:99.7%);透明质酸(HA,华熙福瑞达生物医药有限公司,批号:1510081);聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K90,德国BASF,批号:L96014768E0);甲醇(上海麦克林生化科技有限公司,色谱纯);水为超纯水;其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Unitary C18100Å柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:水-甲醇(90 ∶10);流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;检测波长:282 nm;进样量:20 μl。在该色谱条件下,制针材料、模型药物分离较好,与其他杂质峰均能达到基线分离。

2.2 溶液的制备

2.2.1 熊果苷贮备液的制备 精密称取熊果苷对照品粉末10.53 mg,置于100 ml容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度,配制浓度为105 μg/ml的熊果苷贮备溶液。

2.2.2 制针材料贮备液的制备 分别精密称取HA、PVP K90各100 mg,置于100 ml容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度,配制浓度为1 mg/ml的制针材料贮备液。

2.2.3 可溶微针贴片水溶液的制备 用手术刀片对已制备好的可溶微针贴片进行针部与基层分离,取针部溶解于1 ml去离子水中即得。

2.3 专属性试验

取2.2项下配制的熊果苷贮备液、HA贮备液和PVP K90贮备液适量稀释成适宜浓度的熊果苷溶液、HA溶液和PVP K90溶液。精密吸取这三种溶液和2.2项下配制的可溶微针贴片水溶液各20 μl,按2.1项下色谱条件进样,得到色谱图。由图1可以看出各制针材料溶液色谱图在与熊果苷溶液色谱相应的位置上无相同的色谱峰出现,而可溶微针贴片水溶液与熊果苷溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出现,表明制针材料对熊果苷含量测定无干扰。

图1 HA、PVP K90、熊果苷和可溶微针贴片的HPLC图Figure 1 High performance liquid chromatograms of HA,PVP K90,arbutin and DMNs

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下配制的熊果苷贮备液0.2,0.5,1,1.5,2,3,5,10 ml分别置于10 ml容量瓶中,以超纯水定容,得到浓度为2.1,5.25,10.5,15.75,21,31.5,52.5,105.0 μg/ml的熊果苷系列标准溶液。按照上述2.1项下色谱方法进行分析,根据色谱图谱计算峰面积,以峰面积(Y)对熊果苷浓度(X)进行线性回归,绘制标准曲线,得回归方程为Y=49 409X-12 169(r=1)。结果表明,熊果苷进样浓度在2.1-105.0 μg/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度 精密吸取2.4项下配制的浓度为10.5,52.5,105.0 μg/ml的熊果苷标准工作液,按2.1项下色谱条件连续测定3次,每次进样20 μl,结果见表1。试验结果表明3个浓度熊果苷标准工作液日内精密度的平均RSD值为1.83%。

表1熊果苷的日内精密度

Table1Intradayprecisionresultsofarbutin

浓度(μg/ml)峰面积平均峰面积SDRSD(%)平均RSD(%)10.5503017509725.678602.381.691.8350673651942452.52563675257972647259.631.8325425832632921105.050431575138194101220.201.9751267935244632

2.5.2 日间精密度 取2.5.1项下3个浓度的熊果苷标准工作液,于3 d内每天的相同时段连续进样3次,每次进样20 μl,结果见表2。试验结果表明3个浓度熊果苷标准工作液日间精密度的平均RSD值为1.50%。

2.6 加样回收率试验

按2.2项下方法配制各种贮备液,得到浓度为104 μg/ml的熊果苷贮备液与浓度均为1 mg/ml制针材料溶液,并按照表3配制药物辅料混合溶液。熊果苷与混合辅料浓度比为1 ∶20,1 ∶10,1 ∶5,其中混合辅料浓度保持不变,总浓度为200 μg/ml,各辅料均为100 μg/ml。熊果苷浓度分别为10.4 μg/ml,20.8 μg/ml,41.6 μg/ml。将各混合溶液按含量测定方法测定,结果见表4。试验结果表明,熊果苷的平均回收率在97.22%-99.22%之间,RSD值均在0.67%-1.66%之间。

表2熊果苷的日间精密度

Table2Interdayprecisionresultsofarbutin

浓度(μg/ml)峰面积平均峰面积SDRSD(%)平均RSD(%)10.5509725.675075366348.981.251.50500382512500.3352.52579726258615835644.721.3825541672624581105.05138194509314595279.991.8751575474983694

表3加样回收率试验样品配制方法

Table3Sampleofpreparationmethodsforrecoverytest

药物辅料浓度比熊果苷(104 μg/ml)Dex(1 mg/ml)PVP K90(1 mg/ml)超纯水1∶201 ml1 ml1 ml定容至10 ml1∶102 ml1 ml1 ml定容至10 ml1∶5 4 ml1 ml1 ml定容至10 ml

表4熊果苷的加样回收率

Table4Recoveryresultofdeterminationofarbutin

加入浓度(μg/ml)实测浓度(μg/ml)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.410.3399.3398.911.1610.3899.8110.1597.6020.820.87100.3499.221.6620.80100.0020.2497.3141.640.1896.5997.220.6740.4197.1440.7497.93

2.7 重复性试验

取实验室自制的同一批可溶微针贴片6片,分别用手术刀片进行针部与基层分离,取针部分别于1 ml去离子水中完全溶解后按2.1项下色谱条件进样,计算每片可溶微针贴片针部的熊果苷载药量。结果得出平均每片可溶微针贴片中熊果苷的含量为30.65 μg,RSD为0.82%(n=6),表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取2.7项下某一可溶微针贴片溶液,分别于0,1,2,4,6,12,24 h进样,测定峰面积,熊果苷峰面积RSD值为1.60%(n=7),结果表明可溶微针贴片溶液在24 h内稳定。

3 讨论

使用双光束紫外可见分光光度计分别对熊果苷标准品溶液及制针材料溶液进行全光谱扫描，扫描波长范围为200-700 nm。从扫描谱图中可看出熊果苷标准品溶液在282 nm处有最大吸收峰，且当检测波长为282 nm时系统专属性良好，故本实验选择282 nm作为检测波长。参考相关文献[9-11]，将甲醇-水为10 ∶90和20 ∶80以及盐酸缓冲液(0.1 mol/L盐酸水溶液-水为1 ∶89)-甲醇为95 ∶5这三种流动相依次进行分离实验，流速为1.0 ml/min。结果表明，在流动相为甲醇-水为10 ∶90时，熊果苷色谱峰保留时间适宜，峰形良好。并且各制针材料溶液色谱图在与熊果苷溶液色谱相应的位置上无相同的色谱峰出现。本文建立了HPLC法测定可溶微针贴片中熊果苷的含量，此方法简便、准确、重现性好、精密度高、选用的制针材料无干扰，可作为可溶微针贴片中熊果苷含量测定质量控制方法。

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