首发精神分裂症DNMT1基因多态性与认知功能关系☆

翟金国 苗庆山 高燕 陈敏 周亚楠 魏钦令 李君

精神分裂症可能是多基因遗传的疾病，全基因组扫描发现100多个DNA位点可能与精神分裂症有关[1]，然而，传统遗传学研究并没有突破性进展[2]。表观遗传学认为精神分裂症是遗传与环境因素共同作用的结果[3]。DNA甲基化（DNA methylation）是发现最早、研究最多的表观遗传修饰途径，对正常发育至关重要[4]。DNA甲基化由3个DNA甲基转移酶 （DNA methyctransferace，DNMT）完成，其中DNMT1在人类细胞中最丰富[5]。SARADALEKSHMI等[6]研究认为，DNMT基因多态性可能与精神分裂症表观遗传易感性有关。还有研究发现，DNMT1甲基化变异可能增加早发精神分裂症的患病风险[7]。DNA甲基化对个体正常发育，尤其是神经发育至关重要，而精神分裂症的神经发育假说越来越受到重视，其认知功能、阴性症状都可能与神经发育异常有关。由此提出：DNMT是否会影响精神分裂症患者的认知功能呢？目前鲜有文献对此进行研究。因此，本研究将探讨DNMT1基因多态性是否影响首发、未用药精神分裂症患者的认知功能。

1 对象与方法

1.1 研究对象精神分裂症组来自济宁医学院第二附属医院2015年6月至2017年6月的精神分裂症患者。入组标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂症的诊断标准；②首次发病，病程≤2年，未使用精神药物，半年内未曾接受过电抽搐治疗；③18～40岁；④受教育时间≥6年，理解知情同意书内容；⑤汉族，男女不限，右利手；⑥视力或矫正视力正常；⑦阳性和阴性症状量表（positive and negative symptom scale，PANSS）总分≥70 分，以下4个条目至少有1个条目超过4分：P1-妄想，P2-概念紊乱，P3-幻觉行为，P6-猜疑/被害；⑧能够合作完成认知功能的评定。排除标准[8]：①有脑外伤、神经系统疾病或其他重大躯体疾病史；②有酒精或其他药物滥用或依赖史，或目前存在药物滥用；③目前患有其他任何精神疾病或可能影响认知功能的其他疾病；④智力障碍，认知功能测试不能完成者；⑤有自杀或伤害他人的危险；⑥妊娠或哺乳期妇女。

对照组招募自济宁市某高校、医院和企业。入组标准：①无任何现患精神疾病或精神疾病史；②18～40岁；③教育时间≥6年，理解知情同意书内容；④汉族，男女不限，右利手；⑤视力或矫正视力正常。排除标准同精神分裂症组。

纳入精神分裂症患者186例，男98例，女88例 ，年 龄 （30.62±7.63） 岁 ，受 教 育 时 间 （11.41±2.42）年，发病年龄（23.76±5.48）岁，病程（1.22±0.82）年，PANSS 得分（72.54±18.62），精神障碍家族史阳性率27.96%。对照组共纳入182名健康对照，男性 95 名，女性 87 名，年龄（29.84±6.86）岁，受教育时间为（13.64±3.25）年，精神障碍家族史阳性率9.89%。精神分裂症组与对照组性别、年龄、受教育时间、职业差异无统计学意义（均P＞0.05），而两组间精神障碍家族史阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。

本研究经济宁医学院和济宁医学院第二附属医院伦理委员会批准。全部研究对象均签署书面知情同意书。

1.2 临床评定

1.2.1 临床病理症状评定 在基线采用PANSS评估患者的临床病理症状，同时收集两组被试性别、年龄、职业、民族、家族史等社会人口学资料。

1.2.2 认知功能评定 采用MATRICS成套共识认知功能评定工具[MATRICS（the measurement and treatment research to improve cognition in schizophrenia） consensus cognitive battery，MCCB]中文版对所有被试进行认知功能评价[9]。该测试共7个维度，包括信息处理速度、注意/警惕性、工作记忆、语言学习、视觉学习、推理、问题解决和社会认知。每个维度选取1个分测验进行评估：①信息处理速度，选择连线测验A部分（trailmaking test,part A）；②注意/警惕性，选择持续操作测验（continuous performance test，CPT），结果取 CPT1、CPT2和CPT3的平均值；③工作记忆，选择空间广度测验（spatial span test，SST）；④言语学习，选择霍普金斯言语学习测验修正版（Hopkins verbal learning test-revised，HVLT-R）；⑤视觉记忆，选择简易视觉空间记忆测验修订版 （brief visuospatialmemory test-revised，BVMT-R）；⑥推理、问题解决，选择迷宫测验（mazes test，MT）；⑦社会认知，选择情绪管理测验（emotionmanagement test，EMT）。

所有参与研究的人员均具有中级及以上职称，经过课题组统一培训，培训内容包括研究方案、PANSS和认知功能评定工具MCCB使用。5名研究者对10例患者进行PANSS评定的一致性良好（ICC=0.95），MCCB培训采用北京大学于欣主编的《MCCB 中国常模手册》[9]。

1.3 SNP选择与基因检测于早晨6:00-7:00抽取被试者肘静脉血10 mL，12 g/L依地酸抗凝，常规酚氯仿法提取基因组DNA，置于-70℃条件下保存备用。采用聚合酶链反应（PCR）技术对基因多态性进行分析[8]。根据功能意义、最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF） 和 标 签 状 态 选 择SNPs。中国汉族人群基因型数据及其上、下游区域约2 kb的序列从HapMap下载，因为MAF＞5%，呈连锁不平衡 （r2=0.86），所以选取rs2114724和rs2228611两个SNPs。rs2114724多态性上游引物：5′-GGTCTCCAGTCTTCACTCTGGTCCC-3′，下游引物 ：5′-GCCGCATCCTTACCTCTGTCCCAGC-3′；rs2228611多态性上游引物：5′-CAAAACCAATCTATGATGATGACCC-3′， 下 游 引 物 ：5′-TCTCTTGAAGGTAAGGAATAGTCCG-3′。 PCR 循环条件为96℃预变性5 min，继之以96℃变性45 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 45 s， 进行 36个循环，出循环后72℃再延伸10 min。PCR反应产物为 222 bp，取其中的 3 pL，加入 BsuRI内切酶5 U，置于37℃温育箱内酶切过夜，然后通过4%琼脂糖水平凝胶电泳分离鉴定基因型。电泳后，经Gel Doc2000成像系统成相并读取基因型。

1.4 统计学方法利用Plink软件，采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用SPSS 19.0完成其他统计学分析。两组间年龄、受教育时间等比较采用独立样本t检验，性别分布、基因型和等位基因分布情况比较采用χ2检验，不同基因型患者认知功能比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 Hardy-W einberg平衡检验精神分裂症组和对照组 rs2114724（χ2=0.534，P=0.554）和 rs2228611（χ2=0.648，P=0.456）多态性位点的基因频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 rs2114724的基因多态性精神分裂症组和对照组 SNP rs2114724的 T/T、T/C、C/C基因型分布以及T、C等位基因分布组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 1。

2.3 rs2228611的基因多态性精神分裂症组和对照组SNP rs2228611的G/G、G/A、A/A基因型分布以及G、A等位基因分布差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 1。

2.4 rs2114724不同基因型患者认知功能T/T、T/C和C/C基因型精神分裂症患者之间认知功能评定成 绩 比 较 ，TMT-A、CPT、HVLT-R、BVMT-R、MT和EMT得分差异均无统计学意义（P＞0.05）。SST成绩差异具有统计学意义（F=3.892，P=0.037），经两两比较，具有C/C基因型精神分裂症患者的SST 成绩优于 T/T（P=0.018）和 T/C（P=0.022）基因型的患者，T/T和T/C基因型患者SST成绩差异无统计学意义（P=0.675）。见表2。

表1 精神分裂症组和对照组DNMT1基因SNP rs2114724和SNP rs2228611基因多态性

表2 精神分裂症组DNMT1基因SNP rs2114724不同基因型患者认知功能评分

表3 精神分裂症组DNMT1基因SNP rs2228611不同基因型患者认知功能评分

3 讨论

目前越来越多的证据表明，遗传和环境因素相互作用共同导致精神分裂症的发生[10-11]。DNA甲基化是最常见的表观遗传学过程，该过程中DNA甲基转移酶（DNMTs）起关键作用。DNMTs家族成员中，DNMT1的功能主要是在细胞分裂中维持甲基化状态[5]。DNMT1基因多态性可能影响基因表达，导致不同的临床症状和各种精神疾病[12]。

SARADALEKSHMI等[6]发现DNMT1基因多态性可能是精神分裂症发病的重要表观遗传学因素，南印度人DNMT1的SNPrs2114724和rs2228611基因型和等位基因分布与精神分裂症显著相关[6]。与SARADALEKSHMI等[6]的研究结果不同，本研究结果显示，DNMT1的两个SNPrs2114724和rs2228611的基因型和等位基因分布，在精神分裂症组和对照组之间差异无统计学意义，即提示rs2114724和rs2228611的多态性与首发未用药精神分裂症不存在相关性。出现这种不同的结果，可能系由种族差异造成，也可能与本研究样本量偏小等因素有关。

本研究发现具有C/C基因型精神分裂症患者的SST成绩显著优于T/T和T/C基因型患者。不同的基因型可能决定或影响特定的表型，其中包括临床症状、认知功能。既往研究探索DNA甲基化与认知功能损害的关系已取得一定进展：HU等[13]研究发现，0～2个月大鼠海马DNA甲基化改变，导致认知功能损害，包括工作记忆损害；另有GRINAN-FERRE等[14]针对阿尔茨海默病5XFAD转基因小鼠进行认知功能损害表观遗传机制的研究，在DNMTs家族中发现较高的CpG甲基化和转录改变，年轻小鼠DNMT1水平增加，并与认知水平改变相关；FENG等[15]的人体研究认为，在成人中枢神经系统，DNMT1通过维持DNA甲基化，调节神经元基因表达等交互作用，维持突触的可塑性，为学习和记忆等认知过程所必需。由此可见，DNA甲基化可能与认知功能有关。这些结果更支持DNA甲基化过程异常可能导致认知功能损害。

目前在中国对DNMT1的研究主要集中在肿瘤方面，很少涉及精神分裂症患者DNMT1和认知功能之间的关系，本研究对首发、未治精神分裂症患者开展rs2114724和rs2228611多态性与认知功能之间关系研究，仅发现SNP rs2114724为C/C基因型的精神分裂症患者SST成绩显著优于T/T和T/C基因型的患者，这种差异的原因目前尚难以解释清楚，有待进一步研究。但本研究样本量较小，得到的阴性结果可能存在偏倚。本研究结果虽然未充分证实DNMT1基因多态性与精神分裂症的关系，但是，在一定程度上说明DNMT1基因有可能与认知功能中工作记忆相关。希望本研究能够引起大家对相关基因的研究兴趣，进一步探讨DNMT1基因多态性与精神分裂症及其认知功能之间的复杂关系。

[1]LIZ,CHEN J,YU H,et al.Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia[J].Nat Genet,2017,49（11）:1576-1583.

[2]FATIMA A,FAROOQM,ABDULLAH U,et al.Genome-Wide Supported Risk Variants in MIR137,CACNA1C,CSMD1,DRD2,and GRM3 Contribute to Schizophrenia Susceptibility in Pakistani Population[J].Psychiatry Investig,2017,14（5）:687-692.

[3]KAMINSKY ZA,TANG T,WANG SC,et al.DNA methylation profiles in monozygotic and dizygotic twins[J].Nat Genet,2009,41（2）:240-245.

[4]CHEN Z,LIS,SUBRAMANIAM S,et al.Epigenetic Regulation:A New Frontier for Biomedical Engineers[J].Annu Rev Biomed Eng,2017,19（6）:195-219.

[5]POGRIBNY IP,BELAND FA.DNA hypomethylation in the origin and pathogenesis of human diseases[J].Cell Mol Life Sci,2009,66（14）:2249-2261.

[6]SARADALEKSHMIKR,NEETHA NV,SATYAN S,et al.DNA methyl transferase （DNMT） gene polymorphisms could be a primary event in epigeneticsusceptibility to schizophrenia[J].PLoSOne,2014,9（5）:e98182.

[7]YUEW,YU X,ZHANG D.Progress in genome-wide association studies of schizophrenia in Han Chinese populations[J].NPJSchizophr,2017,3（1）:24-34.

[8]ZHU X,GU H,LIU Z,et al.Associations between TCF4 gene polymorphism and cognitive functions in schizophrenia patients and healthy controls[J].Neuropsychopharmacology,2013,38（4）:683-689.

[9]于欣.MCCB中国常模手册 [M].北京:北京大学医学出版社,2014:15-90.

[10]PALHA JA,SANTOS NC,MARQUES F,et al.Do genes and environment meet to regulate cerebrospinal fluid dynamics?Relevance for schizophrenia[J].Front Cell Neurosci,2012,6（8）:31.

[11]丁文华,崔东红.基因与环境交互作用精神分裂症动物模型的研究进展[J].神经疾病与精神卫生,2016,16（2）:236-238.

[12]DONG E,RUZICKA WB,GRAYSON DR,et al.DNA-methyltransferase1 （DNMT1） binding to CpG rich GABAergic and BDNF promoters is increased in the brain of schizophrenia and bipolar disorder patients[J].Schizophr Res,2015,167 （1-3）:35-41.

[13]HU Y,PANG W,HE C,et al.The cognitive impairment induced by zinc deficiency in rats aged 0～2 months related to BDNFDNA methylation changes in the hippocampus[J].Nutr Neurosci,2017,20（9）:519-525.

[14]GRINAN-FERRE C,SARROCA S,IVANOVA A,et al.Epigenetic mechanisms underlying cognitive impairment and Alzheimer disease hallmarks in 5XFAD mice[J].Aging（Albany NY）,2016,8（4）:664-684.

[15]FENG J,ZHOU Y,CAMPBELL SL,et al.Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrainneurons[J].Nat Neurosci,2010,13 （4）:423-430.