臭氧降解玉米赤霉烯酮及其降解产物细胞毒性

王轶凡 ， 孙秀兰 ， 张银志 ， 丁小霞

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学 食品安全与营养协同创新中心，江苏 无锡214122；4.中国农业科学院 油料作物研究所，湖北 武汉430062）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，Zen）是一种由禾谷镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物，学名为6-（10-羟基-6-氧基-十一碳烯基）β-雷锁酸内酯[1-2]。玉米赤霉烯酮是污染粮食谷物最广泛的真菌毒素之一，其在大麦、燕麦、黑麦、高粱和小麦中的污染都有报道。由于玉米赤霉烯酮与17β-雌二醇（E2）在化学结构上存在相似性，玉米赤霉烯酮及其衍生物在哺乳动物中会产生强类雌激素效应，从而导致体内内分泌紊乱[3-7]。

真菌毒素的脱毒方法主要有物理法、化学法和生物法。而臭氧作为一种强效的氧化剂，其降解黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素等真菌毒素已见诸报道[8-12]。臭氧处理真菌毒素污染的玉米、花生、大麦、小麦和其他谷物已经开始得到初步应用。200 mg/min的臭氧经过92 h处理黄曲霉毒素污染的玉米后，黄曲霉毒素降解超过95%[12]。

臭氧可以由电化学放电产生，具有高效快速、渗透能力强和自身降解产物无毒副作用的优点。但是，经臭氧处理后的真菌毒素降解产物的相关研究鲜有出现在国内外研究中，因此作者研究了臭氧处理玉米赤霉烯酮后的降解产物，并对其降解产物进行了肝癌细胞毒性评价。同时通过超高效液相色谱串联质谱建立了检测玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮主要臭氧降解产物和其生物体内转化产物玉米赤霉烯醇的检测方法，探究特定条件下臭氧处理污染谷物时玉米赤霉烯酮及其降解产物变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米粉：市售；玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇标准品：Sigma公司产品；臭氧发生器：佳环电器科技有限产品；MTN-2800w氮吹仪：天津奥特赛思仪器公司产品；AcquityTM超高效液相色谱仪和AcquityTMTQD串联质谱检测器：美国Waters公司产品；超纯水制备仪：美国Millipore公司产品。HepG2人肝癌细胞：中国科学院细胞库产品；DMEM高糖培养基：Hyclone公司产品。胎牛血清（FBS）：Gibco 公司产品；CCK-8 试剂盒，碧云天生物技术公司产品；Infinite 1000酶标仪：Tecan公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米赤霉烯酮的臭氧处理 在室温下，将5mL的玉米赤霉烯酮溶液 （20μg/mL）通入60mL/min的臭氧1 min。将反应后的溶液通过UPLC-QTOF进行检测。

质谱检测采用电喷雾电离正离子（ESI+）的离子化模式，具体参数如下：毛细血管电压，3.5 kV；离子源温度，100℃；脱溶剂气温度，300℃；脱溶剂气流量，700 L/h。

1.2.2 HepG2人肝癌细胞培养 HepG2肝癌细胞培养在含质量分数10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中，在37℃，体积分数5%CO2条件下恒温培养，每2～3天按1∶3比例传代。

1.2.3 CCK-8法测定HepG2肝癌细胞活力 取对数生长期的肝癌细胞，PBS洗3次，用胰蛋白酶消化适当时间后，用DMEM培养液将细胞浓度调整为1×106/mL。向96孔培养板中加入上述细胞悬液100μL，将培养板至于体积分数5%CO2、37℃下培养12h后取出，分别加入不同浓度的玉米赤霉烯酮及臭氧处理1、3、10 min后的玉米赤霉烯酮DMEM培养液各10 μL，每个设样品置6个复孔。继续在体积分数5%CO2、37℃下培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL。孵育2 h后，用酶联检测仪在450 nm波长下进行测定各孔光密度值，计算出HepG2人肝癌细胞的活力。

1.2.4 超高效液相色谱串联质谱法测定玉米赤霉烯酮及其降解产物 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱；梯度洗脱的流动相条件与1.21的流动相条件相同。离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）和负离子模式（ESI-）。玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯酮（α-Zen）、β-玉米赤霉烯酮（β-Zen）和臭氧降解产物的质谱条件列于表1。定量方法采用的是多反应监测（MRM）模式。采集的数据通过MassLynx 4.1软件进行加工处理。

1.2.5 标准储备溶液的配置 Zen、α-Zen和β-Zen标准溶液：称取适量Zen、α-Zen和β-Zen标准品，以色谱纯乙腈溶解并配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，于2～8℃条件下保存。

通过制备型液相，将臭氧降解玉米赤霉烯酮产物中含量较多的Compound 2、Compound 4分离富集，经冻干浓缩后获得固体。再以色谱纯乙腈溶解并配成质量浓度为100 μg/mL的溶液，于2～8℃条件下保存。

1.2.6 玉米赤霉烯酮污染玉米粉的臭氧处理 准确称取5.00 g玉米赤霉烯酮污染的玉米粉，分别经过 60 mL/min 的 臭 氧 处 理 0、5、15、30、45、60、90min。每份处理后的玉米粉置于50 mL离心管中，加入体积分数80%乙腈溶液20 mL，振荡处理15 min后，取过滤后的滤液5 mL，加入三氯甲烷5 mL，振荡1 min，避光静置。待溶液分层后，保留下层。上层再加入1 mL的三氯甲烷，振荡1 min后，静置分层，保留下层。将两次保留的下层溶液混合，经氮气吹干后，加入1 mL的体积分数80%乙腈溶液，过0.22 μm有机相滤膜后，等待检测。

2 结果与分析

2.1 臭氧处理玉米赤霉烯酮

图1显示玉米赤霉烯酮标准溶液 （20 μg/mL）经臭氧处理1 min后，经液相检测在保留时间5.905、7.323、9.035、9.312 min 分别产生了 4 种降解产 物 Compound 1、Compound 2、Compound 3 和Compound 4。同时，未经臭氧处理时在9.104 min出峰的玉米赤霉烯酮被完全降解。McKenzie等人[16]在臭氧处理玉米赤霉烯酮15 s后并没有发现任何液相色谱仪可检测到降解产物。这可能是由于其臭氧浓度过高，或者玉米赤霉烯酮浓度过低，导致臭氧降解产物短时间内被臭氧完全氧化。经超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测，玉米赤霉烯酮的 [M+H]+是 319.154 3 （m/z）， 而 Compound 1、Compound 2、Compound 3和 Compound 4的 [M+H]+分别是 335.184 1、351.190 7、321.186 8 和 367.175 3（m/z）（图 2）。

图1 20 μg/mL玉米赤霉烯酮臭氧处理前后的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of zearalenone standard solutions at 20 ppm in acetonitrile solution and treated by ozone for 1.0 min（inset）

图2 玉米赤霉烯酮臭氧降解产物的Q-TOF质谱图Fig.2 UPLC Q-TOF MS spectrum of zearalenoneozonolytic products

2.2 玉米赤霉烯酮降解产物的细胞毒性实验

玉米赤霉烯酮最先在生物体内的肝脏进行初级代谢，且玉米赤霉烯酮对肝脏有损伤作用。因此选择人肝癌细胞HepG2对玉米赤霉烯酮的降解产物进行细胞毒性探究。如图3玉米赤霉烯酮对HepG2细胞增殖的抑制率呈现剂量相关性，根据试验中玉米赤霉烯酮染毒质量浓度（0.1～50 μg/mL）对应的细胞增殖率，使用SPSS软件进行分析，计算出玉米赤霉烯酮对HepG2细胞的半数抑制浓度IC50大约是10 μg/mL。以此IC50浓度作为后续细胞毒性实验的浓度。将10 μg/mL的Zen溶液和臭氧处理1、3、10 min 的 10 μg/mL 的 Zen 溶液通过 CCK-8试剂盒来测定其对HepG2细胞增殖的抑制率。经测定臭氧处理1、3 min后，溶液中检测不到Zen，仅含Zen降解产物；处理10 min后，溶液中检测不到Zen和Zen的降解产物。如图3所示结果，与未加玉米赤霉烯酮的Control组相比，玉米赤霉烯酮臭氧处理时间0 min时，玉米赤霉烯酮对HepG2人肝癌细胞生长有显著性抑制 （P＜0.05）。臭氧处理1 min和3 min组即玉米赤霉烯酮的臭氧降解产物，对人肝癌细胞生长有显著性抑制，但相比于玉米赤霉烯酮臭氧处理0 min组，细胞活力显著升高。臭氧处理10 min组即玉米赤霉烯酮臭氧降解产物也被氧化后，其对人肝癌细胞生长的影响没有显著性抑制 （P＞0.05）。这表明玉米赤霉烯酮经臭氧处理后，臭氧降解产物对人肝癌细胞生长存在抑制影响，但低于玉米赤霉烯酮对肝癌细胞的抑制程度。因此臭氧处理污染谷物过程中，足够的臭氧浓度和处理时间对于确保氧化玉米赤霉烯酮及其降解产物是必要的。

图3 不同质量浓度玉米赤霉烯酮对HepG2细胞活力的影响和玉米赤霉烯酮处理后对HepG2细胞活力的影响Fig.3 Dose-response curves fitting with logistic function of zearalenone on HepG2 cells and effects of zearalenone solutions treated with diverse levels of ozone on cell viability

2.3 超高效液相色谱串联质谱法测定玉米赤霉烯酮及其降解产物

经过3种色谱柱的优化ACQUITY UPLC HSS T3柱，ACQUITY UPLC BEH130C18柱和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱，得出ACQUITY UPLC HSS T3 柱 对 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen、β-Zen 分离效果最好。 通过对不同流动相配比的优化，得出最佳梯度洗脱的程序如方法所示。针对单个分析物标准品溶液上机分析，得到目标分析物的质荷比。在碰撞诱导解析电离模式下，优化了各目标物的去簇电压和碰撞电压，获得离子丰度较大的碎片离子为该目标物的裂解的主要碎片离子。表2为在ESI模式下，各目标物的主要碎片离子的质荷比。图4为超高效液相色谱串联质谱在MRM模式下的各目标物的选择离子流图。

表1 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen 的质谱分析参数Table 1 Analytes and polarity modes，MRM transitions，cone voltages and collision energies used for quantitation and confirmation of zearalenone and ozonolytic products

2.4 臭氧处理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉

臭氧处理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉后，经提取，检测出在臭氧处理玉米赤霉烯酮标准溶液相同的降解产物，Compound 2和Compound 4。并没有发现玉米赤霉烯酮的初级代谢物α-Zen和β-Zen。臭氧处理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉90 min后，玉米赤霉烯酮的降解率达到95.1%。图6表明，未进行臭氧处理时，玉米粉中并没有Compound 2和Compound 4，臭氧处理0～15 min时，随着玉米赤霉烯酮的减少，Compound 2和Compound 4含量增加。随着臭氧继续处理，臭氧在氧化玉米赤霉烯酮的同时，继续氧化降解产物Compound 2和Compound 4，因此，此后Compound 2和Compound 4持续减少。

图4 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen 的MRM图谱Fig.4 MRM spectrums of Zen and Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen

图5 玉米粉中臭氧降解玉米赤霉烯酮效果Fig.5 Changesofzearalenonewith theincreasing oxidative time in corn flour

图6 玉米粉中玉米赤霉烯酮臭氧降解过程中降解产物的变化Fig.6 Changes of zearalenoneozonolytic products with the increasing oxidative time in corn flour

3 结 语

臭氧制备简单，高效快捷方便，可能处理的玉米赤霉烯酮污染的粮食或者饲料规模较大。因此，足够的臭氧浓度或臭氧处理时间来降解玉米赤霉烯酮及其降解产物，有助于彻底解决臭氧处理玉米赤霉烯酮过程中，其中间产物依然存在毒性的问题。

作者建立的超高效液相色谱串联质谱检测玉米赤霉烯酮及其降解产物的方法，在臭氧处理玉米赤霉烯酮污染实际谷物和饲料过程中，能够简便快速灵敏准确检测出玉米赤霉烯酮及其降解产物的含量，为实际脱毒生产中臭氧的用量提供参考。

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