重金属Cd对大鼠睾丸间质瘤细胞R2C孕酮合成的影响

卢军利， 孙建霞， 文罗娜， 白卫滨*， 焦 睿， 欧仕益， 杨 勇

（1.四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014；2.暨南大学 食品科学与工程系，广东 广州 510632；3.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006）

重金属镉可以通过食物链进入体内，分布到全身各个器官，重金属镉会对肾、肝、肺、心血管、睾丸等系统产生一系列损伤。且镉的半衰期长达15～30年。由于镉容易在体内蓄积，所以一些动物性食品中镉含量较高，浓度可达几十至数百倍[1-3]。

重金属镉对雄性和雌性的生殖系统都有损害作用，但雄性生殖系统对镉的敏感性要高于雌性生殖系统，动物雄性生殖器官睾丸是重金属染毒受损严重的靶器官之一，除了对雄性性腺发育有不良影响外，镉还对睾丸和附睾也有毒副作用[4]。目前，重金属Cd的雄性毒性研究主要集中在动物实验上，而对体外睾丸间质细胞研究较少，损伤机理不是很明确。且对重金属暴露的睾丸间质细胞毒性损伤的研究主要是集中于对睾酮生成途径中相关酶的影响[5]，孕酮是合成睾酮的前体物质，作者通过CdSO4对R2C细胞孕酮合成通路的影响，探讨重金属镉引起的雄性生殖毒性机制，为重金属Cd的食品安全评估提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

R2C细胞：购自 CCTCC；CdSO4（纯度为 98%）：百灵威公司产品；F-12 basic（1X）培养液、胎牛血清（FBS）、胰酶、马血清：美国 Gibco 公司产品；MTT、DMSO：美国Amresco公司产品；I125孕酮放射免疫分析药盒：北京北方生物技术研究所产品；活性氧检测试剂盒：碧云天生物技术研究所产品；StAR兔抗大鼠抗体 Cell Signaling Technology；CYP11A1兔抗大鼠抗体 Cell Signaling Technology；GAPDH兔抗大鼠抗体proteintech。

CO2培养箱：美国 Thermo公司产品；流式分析仪：美国BD公司产品；酶标仪美国：Thermo公司产品；GC-1200 γ放射免疫计数仪：安徽中科中佳公司产品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测Cd对R2C细胞增殖的影响将对数期的R2C细胞用胰酶消化、离心、重悬、计数，接种于96孔板中，每孔8 000个细胞，每个浓度组设置3个复孔。在细胞培养箱中培养24 h，吸弃孔内培养基，加入用完全培养基稀释的CdSO4溶液，使每组 CdSO4作用浓度分别为 0、10、20、40、80、160 μmol/L，并设有空白组（不含细胞）。 CdSO4作用24 h后，避光加入加噻唑蓝（MTT）溶液，每孔 20μL，细胞培养箱中孵育4 h，吸弃孔内液体，避光加入DMSO溶解蓝紫色甲瓒结晶，每孔150 μL，脱色摇床上摇匀10 min，使沉淀充分溶解，490 nm波长下测定OD值。

用SPSS软件分析得出Cd作用于R2C细胞的IC25、IC50、IC75浓度值。

1.2.2 放射免疫 （radioimmunoassav，RIA）检测Cd对R2C细胞合成孕酮的影响 将对数期的R2C细胞用胰酶消化、离心、重悬、计数，接种到6孔板中，每孔4×105个细胞，培养基2 mL，在细胞培养箱中培养24 h，吸弃孔内培养基，加入浓度分别为IC25、IC50和IC75的CdSO4溶液，继续培养24 h，吸取上清，按照碘[125I]孕酮放射免疫分析药盒进行测定孕酮合成量。

1.2.3 流式细胞分析仪（FCM）检测Cd对 R2C细胞线粒体膜电位（MMP）的影响 将对数期的R2C细胞用胰酶消化、离心、重悬、计数，接种到6孔板中，每孔4×105个细胞，培养基2 mL，细胞培养箱中培养24 h，弃去孔内培养基，加入浓度分别为IC25、IC50和IC75的CdSO4溶液，继续培养24 h，吸弃孔内培养基，胰酶消化，400 g离心5 min，按照线粒体膜电位检测试剂盒进行JC-1染色，用流式细胞分析仪进行检测，每个样品采集104个细胞。

1.2.4 荧光酶标仪检测 CP对R2C细胞的ROS水平影响 将对数期的R2C细胞用胰酶消化、离心、重悬、计数，接种到96孔板中，每孔10 000个细胞。细胞培养箱中培养24 h，吸弃孔内培养基，每孔加入30 μL DCFH-DA溶液 （无血清培养基稀释），细胞培养箱中孵育20 min，无血清F12培养基洗3遍，将孔内残留探针清洗干净，加入分别含IC25、IC50和IC75浓度CdSO4的培养基，荧光酶标仪检测。激发波长488 nm，发射波长525 nm，逐时间点检测Cd作用前后荧光的强弱变化。

1.2.5 Western Blot检测Cd对R2C细胞孕酮合成相关蛋白Star和CYP11A1表达的影响 漩涡震荡15 s，冰浴 45 s，重复操作 1 h，4 ℃离心 30 min，取上清。测定试剂盒检测样品蛋白浓度，制样，然后进行SDS电泳、转膜、免疫杂交、显影。ImageJ软件分析结果。

1.2.6 数据处理 通过SPSS软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析结果，检验水平为p＜0.05时为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 Cd对R2C细胞的生长抑制作用

CdSO4作用24 h后，R2C细胞生长受到抑制，由表1可以看出，重金属Cd能够抑制R2C细胞的生长，且Cd浓度越高，细胞的生长抑制率越大，呈现剂量依赖性，当CdSO4浓度达到160 μmol/L时，细胞抑制率高达95%，通过SPSS软件分析得出Cd对 R2C 细胞的 IC25、IC50、IC75浓度值分别为 （24.93±0.023 5）、（44.80±0.047 9）、（80.51±0.035 7） μmol/L。

2.2 Cd对R2C细胞孕酮合成的影响

在维持正常的雄性生理功能过程中，睾酮起到至关重要的作用[6]，R2C细胞由于缺少表达合成睾酮的相关酶，最终生成孕酮，而孕酮是睾酮合成的前体物质，所以通过检测孕酮水平可以反映雄性激素的变化[7]。由孕酮检测结果可以看出，IC25、IC50、IC753浓度组CdSO4均对孕酮合成有影响。CdSO4溶液浓度越高，孕酮合成量越少，当浓度值达到IC75Z值时，孕酮合成量下降为对照组的40%。

表1 不同浓度CdSO4对R2C细胞生长抑制率的影响Table 1 Inhibitory effect of CdSO4on the growth of R2C cells

图1 不同浓度CdSO4对R2C孕酮合成的影响Fig.1 Effect of CdSO4on progesterone production of R2C cells

2.3 Cd对R2C线粒体膜电位的影响

流式细胞分析仪检测CdSO4浓度为IC25、IC50、IC75暴露24 h后对R2C细胞MMP的影响。通过JC-1染料对R2C细胞进行染色，红色荧光部分为细胞内正常MMP区域，绿色荧光为细胞内MMP降低的部分。结果显示，与对照组相比，IC25、IC50、IC75作用浓度均对R2C细胞MMP有所影响，且随着浓度的增大，线粒体膜电位损伤的比例越大 （图2（a））。数据分析表明：与正常组相比，浓度为IC25时，线粒体膜电位显著下降，损伤严重，IC75值时，线粒体膜电位损伤比率达33%（图2（b））。

2.4 Cd对R2C产生ROS的影响

氧化损伤是重金属雄性毒性的重要损伤学说之一[8]，而各种自由基中，氧自由基（ROS），最为主要，图 3显示，CdSO4刺激 R2C细胞 2、4、8 h时，R0S产生量均有显著提高，4 h时最为明显，且随着Cd浓度的升高，ROS产生的量也相应增多。由于ROS的产生速度非常快，所以Cd作用8 h时R0S产生量有所下降。

图2 不同浓度Cd对R2C细胞MMP的影响Fig.2 Effects of CdSO4on MMP changes of R2C cells

图3 不同浓度Cd对R2C产生ROS的影响Fig.3 Effects of Cd on ROS in R2C cells

2.5 Cd R2C细胞孕酮合成相关基因StAR、CYP11A1蛋白表达的影响

Western Blot实验结果显示：重金属Cd可以抑制StAR、CYP11A1蛋白的表达量，且StAR蛋白的表达量随Cd浓度的升高而下降，与对照组相比，IC25、IC50、IC75浓度作用组的 StAR蛋白的表达量均有显著性差异。而与对照组相比，只有IC75作用浓度可以明显抑制CYP11A1蛋白的表达，说明Cd对StAR蛋白的影响更为显著，结果见图4-6。

图4 Western blot检测不同浓度Cd对R2C细胞StAR和CYP11A1蛋白的影响Fig.4 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

图5 Western blot检测不同浓度Cd对R2C细胞StAR蛋白的影响Fig.5 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

图6 Western blot检测不同浓度Cd对R2C细胞StAR和CYP11A1蛋白的影响Fig.6 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

3 讨 论

动物实验证明，镉可以损伤曲精小管中的生殖细胞，并且镉刺激浓度微量的提高即可引起睾丸损伤的大幅加重[9]，体外实验研究重金属暴露的睾丸间质细胞毒性损伤主要是集中于对睾酮生成途径中相关酶的影响，镉通过氧化损伤途径对睾丸间质细胞孕酮合成能力的影响没有相关报道，作者通过体外实验，研究了Cd雄性毒性作用。结果显示，金属Cd可以显著降低R2C细胞的活性，且浓度越大，作用越强。ROS是体内重要的一种自由基，ROS在机体内保持平衡状态下，有抗菌、消炎等重要作用，但当平衡被打破，会造成生物膜的脂质氧化损伤，从而引起酶、蛋白等氧化损伤，最终导致对身体机能的损害[10-12]。通过测定在Cd的作用下R2C细胞中ROS的产生量，发现Cd能够使细胞中ROS显著提高，随着Cd浓度的升高，产生的ROS的量也显著升高，线粒体损伤比率也显著升高，这是由于ROS的主要产生部位是线粒体的呼吸链，Cd刺激R2C细胞产生过多的ROS，使线粒体DNA、基质中的酶受到ROS攻击而损伤[13]，从而影响线粒体膜电位的正常作用。StAR蛋白和CYP11A1蛋白是整个孕酮合成通路中的关键点，实验结果证明，重金属Cd明显降低StAR和CYP11A1蛋白表达量，StAR蛋白表达量的下降减弱了胆固醇转运至线粒体基质内，CYP11A1蛋白表达量的下降减少了线粒体中孕烯醇酮的合成，从而降低了孕酮的合成。孕酮检测结果对此进行了验证，浓度为IC25、IC50、IC75的Cd刺激R2C细胞24 h后，与对照组相比，各CdSO4作用组的R2C细胞孕酮量都显著降低，且有统计学意义。总之，Cd刺激对体外培养的R2C细胞产生大量的ROS，进而影响线粒体正常功能和StAR、CYP11A1的表达，从而阻碍胆固醇的正常转运和孕酮生成中间物质孕烯醇酮的生成，最终降低R2C细胞孕酮合成量。

[1]KONG Qinghu，CHEN Yunying，WU Jianmin，et al.The combination of cadmium and cadmium and zinc in rats[J].Journal of Zhejiang Academy of Medical Sciences，2001（45）：8-10.(in Chinese)

[2]ZHANG Wenchang，LI Huangyuan，WANG Zhangjing，et al.Study on the comparation about toxicity of cadmium to the female gonad and kidney in rats[J].Chinese Journal of Public Health，2002，18（6）：693-694.(in Chinese)

[3]BUCKKO G W，HESS N J，KENNE M A.Cadmium mutagenicity and human muclotide excision repair protein XAP：CD，EXAFS and （l）H/ （15）N-N MR spectroscopic studies on the zinc （Ⅱ）-and cadmium （Ⅱ）-associated minimal DNA-bindi-g domain（M98-FZ19）[J].Carcinogenesis，2000，21（5）：1051-1057.

[4]TAM P P，LIU W K.Gonadal development and fertility of mice treated prenatally with cadmium during the early organogenesis stages[J].Teratology，1985，32（3）：453-462.

[5]CHENG J，FU JL，ZHOU Z C.The inhibitory effects of manganese on steroidogenesis in rat primary Leydig cells by disrupting steroidogenic acute regulatory（StAR） protein expression[J].Toxicology，2003，187（2-3）：139-148.

[6]MIDZAK A S，CHEN H，PAPADOPOULOS V，et al.Leydig cell aging and the mechanisms of reduced testosterone synthesis[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2009，299（1）：23-31.

[7]ZOU Feiyan，BAI Shun，BAI Weibing，et al.Effects of 3-monochloropropane-1，2-diol on the cell growth in rat leydig tumor cells R2C[J].Journal of Food science and Biotechnology，2013，32（6）：569-573.(in Chinese)

[8]CHENG J，FU J L，ZHOU Z C.The inhibitory effects of manganese on steroidogenesis in rat primary Leydig cells by disrupting steroidogenic acute regulatory（StAR） protein expression[J].Toxicology，2003，187（2-3）：139-148.

[9]DE SOUZA P S F，DIAMANTE M A，DOLDER H.Testis response to low doses of Cadmium in Wistarrats[J].IntJ Exp Pathol，2010,91（2）：125-131.

[10]FORTES G B，ALVES L S，DE OLIVEIRA R，et al.Heme induces programmed necrosis on Macrophages through autocrine TNF and ROS production[J].Blood,2012，119：2368-2375.

[11]TABET F，LAMBERT G，CUESTA T L F，et al.Lipid-free apolipoprotein A-I and Discoidal reconstituted high-density lipoproteins differentially inhibit glucose-induced oxidative stress in human macrophages[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31：1192-1200.

[12]ERDEMIR F，ATILGAN D，MARKOC F，et al.The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters[J].Actas Urol Esp，2012，36（3）：153-159.

[13]AMARAL A，LOURENCO B，MARQUES M，et al.Mitochondria functionality and sperm quality[J].Reproduction，2013，146（5）：163-174.