响应面法优化枳椇子三萜类化合物提取条件研究

（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

枳椇（学名：Hovenia acerba）为鼠李科枳椇属下的一个种。枳椇，为落叶阔叶高大乔木，树高可达30 m，别名拐枣、鸡爪梨、万寿果、结肉子、结肉籽、桔扭子、鸡爪树、鸡爪果、鸡脚爪、万字果、梨爪子等，我国大部份省区均有零星分布。枳椇子呈扁平圆形，背面稍隆起，腹面较平，直径3 mm～5 mm，厚约2 mm。表面红棕色至红褐色，平滑光泽，基部有描圆形点状的种脐，顶端有微凸的合点，腹面有一条纵行而隆起的种脊。种皮坚硬，厚约1 mm，胚乳乳白色，油质，其内包围有2片肥厚的子叶，呈淡黄色至草绿色，亦油质。气微弱，味苦而涩，可清热利尿，止咳除烦，解酒毒，具有医疗价值[1-2]。枳椇含有丰富的保健营养成分，现在国内外常用来做解酒的饮料和预防肝炎的保健食品，应用广泛[3-5]。

三萜类化合物是一类具有广泛抗肿瘤等生物活性的化合物，在自然界中分布广泛[6-7]。其中具有显著抗肿瘤活性的主要包括四环三萜和五环三萜。齐墩果酸和熊果酸是目前研究比较典型的五环三萜，由于三萜类化合物在与香草醛乙酸显色情况下具有同等特性[8-10]，试验以齐墩果酸为对照品，采用响应面法优化枳椇子中三萜类化合物的提取条件[11-16]，以期得到最佳的三萜类化合物提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枳椇子为枳椇种子烘干保存；齐墩果酸标准样品（91.7%）：中国食品检定研究院；冰乙酸、乙醇、香草醛、高氯酸：均为分析纯；实验室用水为去离子水。

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；HWS-24型电热恒温水浴锅、DHG-9245A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；K-06B摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三萜类化合物标准溶液曲线的制定

精密称取齐墩果酸标准样品20 mg置于100 mL容量瓶中，加无水乙醇超声溶解后定容至刻度，摇匀的齐墩果酸标准溶液，每1 mL含0.2 mg齐墩果酸。精密吸取齐墩果酸标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL具塞比色管中，水浴蒸干，加入0.2 mL的5%香草醛-乙酸溶液和0.8 mL的高氯酸，在70℃水浴下反应15min，冰水冷却，加入4 mL冰醋酸后摇匀。在最大吸收峰548 nm波长处测定其吸光度，所得数据经回归处理，得到标准曲线回归方程为y=0.139 8x-0.001 6，式中：x为被测样品中齐墩果酸的质量；y为吸光度；相关系数为R2=0.999 3。

1.2.2 单因素试验设计

准确称取一定量已处理好的枳椇子干粉，分别按一定的液料比，加入不同乙醇溶液，不同水浴温度，不同提取时间平均分为两次进行水浴回流提取后，过滤，定容至100 mL。

1.2.3 三萜类化合物提取率测定。

分别取一定量的提取液于具塞比色管中，按1.2.1方法测定波长在548 nm处的吸光度，根据回归方程以及称样量计算出三萜类化合物的提取率。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken试验设计原理，选取影响提取三萜类化合物的4个因素：水浴温度、液料比、提取时间、乙醇浓度进行响应面优化组合，因素水平设计见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and lenels in the Box-Benhnken

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 水浴温度对三萜类化合物提取率的影响

取0.7 g处理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，分别在 50、60、70、80、90℃水浴温度下提取3 h后，取0.2 mL提取液进行显色测定吸光度，计算出三萜类化合物的提取率，结果如图1。

图1 水浴温度对三萜类化合物提取的影响Fig.1 The effects of bath temperature on the extraction of triterpenoids

由图1可看出，随着水浴温度的升高，三萜类化合物的提取率也升高，当达到70℃时，再升高水浴温度，提取率逐渐下降，说明水浴温度太高对其中三萜类化合物结构造成破坏[7]。因此选择水浴温度为70℃。

2.1.2 液料比对三萜类化合物提取率的影响

分别准确称取 0.4、0.5、0.7、0.8、1.0、1.3 g 处理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，液料比为100、80、60、50、40、30（mL/g），分别在 70℃水浴温度下提取3 h后，取0.2 mL提取液进行显色测定吸光度，计算出三萜类化合物的提取率，结果如图2。

由图2可看出，当液料比60 mL/g后随着液料比的升高三萜类化合物含量上升缓慢。说明当液料比较低时，参与反应的溶剂有限不能使试样中的三萜类化合物完全提取出来，随着液料比的增加，提取率也慢慢升高，当达到60 mL/g时，试剂与试样的反应比例达饱和状态，液料比再提高后对反应没有增加效果[13]，因此选择液料比为60 mL/g较佳。

图2 液料比对三萜类化合物提取的影响Fig.2 The effects of liquid material ratio on the extraction of triterpenoids

2.1.3 水浴时间对三萜类化合物提取率的影响

取0.7 g处理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，在70℃水浴温度下平均分为两次提取，总提取时间为1、2、3、4、5 h 后，取 0.2 mL 提取液进行显色测定吸光度，计算出三萜类化合物的提取率，结果如图3。

图3 水浴时间对三萜类化合物提取的影响Fig.3 The effects of bath time on the extraction of triterpenoids

由图3可看出，当水浴时间为3 h后，随着时间的延长三萜类化合物含量上升缓慢，说明提取初期，有效成分浓度差大，提取率增加明显，当达到3 h后，溶剂中有效成分浓度小，提取率基本不变，因此，水浴时间选择3 h。

2.1.4 不同乙醇浓度对三萜类化合物提取率的影响

取0.7 g处理好的枳椇子干粉，分别加入40 mL 40%，50%，60%，70%，80%乙醇溶液，在70℃水浴温度下提取3 h后，取0.2 mL提取液进行显色测定吸光度，计算出三萜类化合物的提取率，结果如图4。

图4 乙醇浓度对三萜类化合物提取的影响Fig.4 The effects of ethanol concentration on the extraction of triterpenoids

由图4看出随着乙醇浓度的增加对三萜类化合物的提取逐步提高，当达到60%时，提取率最佳。在浓度为80%后，三萜类化合物可能以苷和苷元两种形式存在，苷溶于水，苷元溶于乙醇，乙醇过高或过低都不利于两者的提取[16]。因此，选择乙醇浓度为60%较佳。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面法优化试验模型建立

在单因素试验结果基础上，优化设计响应面及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Designs and results of Box-Benhnken experimental

2.2.2 方差分析与显著性检验

通过Design Expert数据分析软件进行回归分析，得到的方差分析结果如表3所示。

利用Design Exper软件对数据进行回归分析，对各因素拟合，得到三萜类化合物含量Y的回归方程Y=+3.56－0.024A－0.035B+0.023C+0.078D+0.007 75AB－0.031AC－0.018AD+0.058BC+0.021BD－0.028CD－0.17A2－0.18B2－0.16C2－0.16D2。

表3 方差分析结果Table 3 The results of variance analysis

由表3 可知，该模型具有显著性（P＜0.05），模型失拟项 0.069 8（＞0.05）不显著，相关系数 R2=0.954 1，说明回归方程与实际数据间具有较好的拟合性，Radj2=0.908 2，说明可信度较高。从因素 A、B、C、D 对三萜类化合物含量的影响来看，B、D、BC、A2、B2、C2、D2均显著。通过回归方程一次项系数绝对值带下判定本试验中影响因素顺序为D＞B＞A＞C；且 D，A2，B2，C2，D2均极显著。

从图5的残差分布图中可以看出29个试验点基本分布在一条直线上，表明各试验测得值之间相关性好，该模型可以很好的反应各因素与三萜类化合物提取率之间的真实关系，再综合图表可以得出该回归方程能够对响应值进行预测分析。

图5 三萜类化合物提取率的残差分布图Fig.5 The residual distribution of the extraction rate of triterpenoids

2.4 响应面结果分析与优化

根据回归方程做响应面图和等高线图，考察所拟合的响应面的形状，分析液料比、乙醇浓度、水浴温度、水浴时间对三萜类化合物含量的影响，相应的响应面见图6～图11。

模型中A、B、C、D其中两个因素固定在0水平，得到另外两个因素间交互作用对三萜类化合物含量Y的子模型，综合表和图，进行二次多项回归模型线性拟合后可知，枳椇子中三萜类化合物提取的最佳条件为：液料比59 mL/g，乙醇浓度62%，水浴温度69℃，水浴时间183min，在此工艺下，枳椇子的三萜类化合物提取率为3.576 g/100 g。为验证此工艺的优化实际结果，进行该条件下的测试，得到实际值为3.582 g/100 g，所得试验值与理论值相差小，说明经响应面分析方法优化设计的枳椇子提取三萜类化合物的条件是可信的，具有良好的使用价值。

图6 水浴温度和液料比对三萜类化合物提取率的影响Fig.6 Effects of bath temperature and liquid material ratio on the extraction rate of triterpenoids

图7 水浴温度和水浴时间对三萜类化合物提取率的影响Fig.7 Effects of bath temperature and bath time on the extraction rate of triterpenoids

图8 水浴温度和乙醇溶度对三萜类化合物提取率的影响Fig.8 Effects of bath temperature and ethanol concentration on the extraction rate of triterpenoids

图9 液料比和水浴时间对三萜类化合物提取率的影响Fig.9 Effects of liquid material ratio and bath time on the extraction rate of triterpenoids

图10 液料比和乙醇浓度对三萜类化合物提取率的影响Fig.10 Effects of liquid material ratio and ethanol concentration on the extraction rate of triterpenoids

图11 水浴时间和乙醇溶度对三萜类化合物提取率的影响Fig.11 Effects of bath time and ethanol concentration and on the extraction rate of triterpenoids

3 结论

利用响应面分析方法，通过二次回归设计得到枳椇子中三萜类化合物提取率与液料比、乙醇浓度、水浴温度、水浴时间关系的回归模型，从模型的响应面对影响三萜类化合物提取率的因素之间相互作用进行了探讨。得出各因素的主要影响关系为：乙醇浓度＞液料比＞水浴温度＞水浴时间，并确定了提取的最佳条件为液料比59 mL/g，乙醇浓度62%，水浴温度69℃，水浴时间183min，在此条件下得到三萜类化合物的含量为3.582 g/100 g，与其理论值相差较小。

本研究在单因素试验的基础上通过Box-Behnken的中心组合设计及响应面法对各个因素进行了分析，解决了正交试验中只能单一分析的缺陷，得到了最佳提取工艺参数，具有模型预测性好、精确度高的优点。

目前枳椇子在开发利用上仅仅局限于醒酒功能，在对其深入的功效成分开发上一直没有更多的研究，三萜类化合物为具有重要的保健功效成分，枳椇子中三萜类化合物的提取为其在未来开发利用上提供了理论依据。

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