全基因组关联分析馒头比容与质构SNP标记

刘 娟 陈广凤 田纪春 吴 澎 赵子彤 杨 艺 李向阳 唐晓珍

(山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室；山东农业大学食品学院1，泰安 271018) (德州学院生态与景观学院2，德州 253023) (山东农业大学小麦品质育种研究室；山东省作物生物学重点实验室3，泰安 271018)

馒头的比容和质构性状作为影响馒头感官品质和市场销售的重要指标，一直以来都是馒头加工或品质改良研究的热点领域，目前对于馒头比容和质构的研究多倾向于原料、添加剂以及小麦颗粒度等方面[1-6]，对加工技术的研究多于基础研究。小麦是异源六倍体作物，因而对其基因的研究相较于玉米[7]、水稻[8]等较晚，但近几年检测手段的进步，使得对小麦农艺性状及品质性状的的基因研究日趋完善，但对小麦类产品如馒头、面条等感官性状的基因研究尚鲜见报道。

随着当前单核苷酸多态性(SNP)标记研究的快速发展，以及测序技术和基因芯片技术的发展，自动化程度更高的第3代SNP标记已迅速取代SSR、RFLP等传统标记，成为最具有发展潜力的分子标记[9]。SNP标记遗传稳定、数量多、分布广且易于检测的特点使其能满足全基因组关联分析对大样本、高密度标记的要求，适合于数量庞大的检测分析，可极大的提高关联分析的效力[10-11]，现已广泛应用于小麦遗传连锁图谱的构建[12-14]、分子标记辅助育种[15-17]、遗传分析和物种进化等研究方面[18-20]。本研究以205份不同小麦品种为实验材料，通过全基因组关联分析以求找到与馒头比容和质构紧密关联的SNP标记，为从分子层面研究馒头品质性状提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与表型鉴定

205份不同小麦品种，其中203份来自于中国10个种植冬小麦的省份，包括山东138份、河南24份、河北14份、安徽8份、江苏6份、北京5份、陕西4份、甘肃2份、贵州与宁夏分别1份；剩余2份分别来自法国与墨西哥。其中，骨干亲本132份，高代品系73份，高代品系均来源于山东省。

在2014年和2015年间分别将实验材料种植于山东泰安(山东农业大学)和山东德州(德州市农业科学院)，播种时每份材料播种3行，行长2 m，行间距0.25 m，均匀播种70粒。在小麦生长期间，对其进行常规的田间管理，没有出现严重的病虫害及倒伏现象。待小麦成熟后将其进行收割、标记并研磨成粉。馒头的制作参考周素梅等[21]的方法并略做改进。待馒头冷却后开始测量馒头的质量、体积与质构。馒头的体积采用菜籽置换法测量，体积与质量之比即为比容[22]；体积测量结束后，用切割机将馒头沿竖直方向平行切割成3片，取中间片于质构仪上，在TPA模式下采用P35探头进行压缩实验[23]，测试前速率3.00 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后速率1.0 mm/s，下压程度50%。第一次压缩结束后，探头回到起始位置，等待3 s后进行第二次压缩。并采用SPSS 18.0软件统计分析所得数据。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根据稍作改动的Triticarte(http://www.triticarte.com.au)方法提取小麦幼叶中DNA，并用0.8%的琼脂糖电泳对提取到的DNA进行浓度与质量的检测。委托加利弗尼亚大学生物技术检测中心，使用最新开发的90K基因芯片(含81 587个SNP)对实验材料DNA进行分型，并利用Genome Studio软件对分型结果进行读取及保存。为确保得到的基因数据的质量，用PLINK v1.07对基因数据进行处理[24]，选取检出率大于0.8和低频基因频率大于0.05的SNP标记，最终得到24 355个SNP用于馒头比容和质构关联分析。

在参照Wang等[25]整合的遗传图谱的基础上，得到本实验群体的SNP复合遗传图谱信息(表1)。

1.3 性状与标记间的关联分析

运用TASSEL 3.0软件中的MLM模型对馒头比容及质构性状与标记之间进行关联分析，当结果中关联标记的P<0.001时，认为该标记与目标性状存在显著关联；P<0.000 1时，认为标记与目标性状存在极显著关联，当标记在2个及以上环境中同时被检测到则认为其是目标性状相对稳定的关联位点。

2 结果与分析

2.1 比容与质构性状表型变异分析

4个环境下，小麦粉馒头比容与质构表型数据如表2所示。各性状均有较大的变异系数，表2中，E4环境下馒头比容性状的变异系数最大(19.54%)，E1环境下变异系数最小(8.45%)；表3中，E1环境黏着性变异系数最大(58.50%)，弹性变异系数最小(3.21%)。除个别环境外，各性状的偏度和峰度的绝对值大部分都小于1，符合正态分布，表现为数量性状遗传，适合进行关联分析。

表1 SNP复合遗传图谱信息

表2 四个环境下馒头比容、质构在群体中的表型数据

表2(续)

注：E1：2014年泰安点；E2：2014年德州点；E3：2015年泰安点；E4：2015年德州点，余同。

表3 四个环境中与馒头比容、质构性状相关的极显著(P<0.000 1)、高贡献率和稳定位点

表3(续)

2.2 SNP标记与馒头比容、质构相关性状的关联分析

通过对4个环境中小麦粉馒头性状与标记间的关联分析，共得到42个比容性状显著关联位点(P<0.001)，分布于小麦21条染色体中的16条，单个位点表型遗传变异贡献率为6.57%～18.31%。其中8个极显著关联位点(P<0.000 1)，同时也是高遗传贡献率位点(R2>10%)，2个相对稳定位点(在2个及以上环境中表达)，分布于小麦的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色体上。位于4B染色体上的极显著关联位点Tdurum_contig4974_355遗传贡献率最大，可解释17.10%的表型变异，但只在E4环境中检测到(表3)。

4个环境下共检测到313个质构性状显著关联位点，分布于小麦的17条染色体上，单个位点表型变异贡献率为5.49%～25.14%。其中31个极显著(P<0.000 1)关联位点，11个相对稳定关联位点，46个高遗传贡献率位点，分布于小麦的15条染色体上(1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B和7D)。同时，检测到5个极显著位点，如3B染色体上黏聚性关联位点Kukri_c13329_800、7B染色体上咀嚼性关联位点Tdurum_contig61884_836等，在2个环境中表达，且贡献率大于10%，为主效关联位点。

3 讨论

标记本身的特性决定了其在遗传连锁图谱上的分布密度，进而对其所定位的QTL产生影响，本研究整合的遗传连锁图谱全长3 674.16 cm，标记间平均距离0.15 cm，且标记的数量远超过4 000个。因此，该图谱具有分子标记数目较多，覆盖的遗传距离长，标记间平均距离小等突出特点，且该图谱的建成将有助于鉴别和挖掘优异的遗传变异位点。在所有的标记中，B染色体组检测到的标记数目最多，A染色体组次之，D染色体组标记数目最少，这可能是由于小麦D染色体组具有相对较高的保守性造成的[26]。

本研究利用SNP标记对馒头比容和质构相关性状进行关联分析，采用MLM模型，将协变量(每个品种个体的Q值、亲缘关系)纳入回归分析，并设置较高的阈值(P≤0.000 1)来防止因亲缘关系和群体分层所引发的伪关联，从而确保实验结果的可信度。在不同环境中所得到的位点常会出现不一致的情况，或许是由于环境的作用，这是多基因控制的数量性状的首要特点。有些位点在2个及以上环境中同时被检测到，被称作相对稳定的关联位点。与SSR标记相比，SNP标记与功能基因的关联更加紧密，这是由于SNP标记不仅在小麦基因中有遗传稳定、数量多等特点，而且有些基因内的SNP会对蛋白质的结构和表达有直接影响[27]。本研究通过关联分析得到2个比容性状相对稳定位点，11个质构性状相对稳定位点，如E1、E4环境中同时检测到的与比容显著关联的位点tplb0027d07_633,E1、E4个环境中检测到的与硬度关联的位点BobWhite_c8436_391等，可作为参考应用于小麦分子标记辅助育种。

4 结论

利用分布于小麦全基因组的24 355个SNP位点对205份不同小麦粉馒头的比容和质构性状进行全基因组关联分析。检测到42个馒头比容性状显著关联位点，其中8个极显著(P<0.000 1)且高遗传贡献位点，2个相对稳定关联位点，分布于小麦的7条染色体上。检测到313个馒头质构性状显著关联位点，有31个极显著(P<0.000 1)关联位点，11个相对稳定关联位点，46个高遗传贡献率位点(R2>10%)，分布于小麦的15条染色体上。同时，检测到5个质构性状主效关联位点。本实验所得到的这些标记对从分子水平深入研究小麦粉的品质性状具有重要意义，并为小麦分子育种提供参考。

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