五苓散对脑梗死小鼠脑水肿及线粒体生物合成的影响
2018-06-05,,2,,,,,
, ,2, , ,, ,
脑梗死作为一种常见的脑血管疾病,具有较高的致残率和致死率,早期干预可使10%~50%卒中病人的认知功能得到一定程度改善[1-2]。多项研究证实,应用五苓散可有效改善病人脑水肿和神经功能损伤症状,但具体机制尚不明确。线粒体是机体能量代谢的重要场所,线粒体功能障碍与细胞毒性脑水肿及神经功能损伤程度密切相关,提示线粒体可能是五苓散发挥脑保护作用的重要靶点之一[3-5]。本研究拟通过构建小鼠脑缺血再灌注(MCAO)模型,探讨五苓散对脑水肿的影响,并进一步检测线粒体生物合成相关基因表达及线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数的变化,为五苓散治疗脑梗死的机制研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂、仪器 雄性C57BL/6小鼠30只,体重25 g~30 g,购于军事医学科学院动物实验中心。总RNA/DNA共提取试剂盒(天根公司),cDNA第一链合成试剂盒(天根公司),real-time PCR剂盒(康为世纪公司),real-time PCR仪(美国ABI公司,Step One Plus),小动物麻醉机(瑞沃德公司)。
1.2 方法
1.2.1 五苓散配制 茯苓9 g,猪苓9 g,白术9 g,泽泻15 g,桂枝6 g,煎煮两次,合并药液后稀释成1 g/mL,4 ℃保存。
1.2.2 分组及相应手术操作 将小鼠随机分为对照组(S组)、大脑中动脉栓塞组(MCAO组)和五苓散组(W组),各10只。MCAO组和W组采用线栓法构建右侧大脑中动脉栓塞模型:首先,以400 mL/min流量,2%浓度异氟烷麻醉小鼠后,取颈正中切口,分离颈内、外动脉;其次,结扎颈外动脉根部和颈总动脉近心端,另分别在颈内动脉和颈总动脉距远心端3 mm~5 mm处套线不结扎,为下一步线栓插入做准备;最后,颈总动脉远心端处夹一动脉夹,并在颈总动脉两线之间剪一斜形切口,将单丝尼龙线(6-0)从切口插入至动脉夹处,之后结扎颈总动脉远端套线,松开动脉夹,继续向颈内动脉插入1 cm左右,遇阻力时即停止,缝合皮肤并将线栓一头留在体外,1 h后拔出线栓完成再灌注。MCAO组按1 mL/100 g给予生理盐水灌胃,每日3次;W组按1 mL/100 g给予五苓散灌胃,每日3次;S组仅暴露颈内动脉后缝合皮肤。
1.2.3 MCAO模型评价 麻醉清醒后,小鼠出现如下3种状态之一,认为MCAO造模成功:①不能完全伸展单侧前肢;②向单侧转圈;③向单侧倾斜[6]。
1.2.4 神经功能损伤评分(mNSS)及标本采集 3组小鼠均于术后72 h行mNSS评分[6],分数越高说明症状越严重,0分为正常,最严重为18分。评价完成后采用颈椎离断法处死小鼠,MCAO组及W组留取缺血半暗带同一部位约10 mg脑组织,S组留取相应部位脑组织。剩余脑组织进行干湿比重测量。
1.2.5 相关基因表达及mtDNA拷贝数测定 按照试剂盒说明书,提取脑组织的总RNA和基因组DNA,并将RNA反转录成cDNA,以测定线粒体生物合成相关基因的表达变化,包括受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α)、核呼吸因子1和2(nuclear respiratory factor 1/2,NRF1/2)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)及线粒体单拷贝基因COX2。方法如下:配制PCR反应体系,包括2×UltraSYBR Mixture,cDNA 10 ng或基因组DNA 50 ng及相应体积的引物和灭菌双蒸水,每个基因设置3个重复孔。反应条件采用两步法:95 ℃,10 min预变性,随后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40个循环测定CT值,以0.3 ℃梯度逐步升温行融解曲线分析。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.2.6 脑组织含水量测定 去除嗅球、小脑和脑干后,分离左右大脑半球,立即称重(湿重)。之后将大脑放入烘干箱中,75 ℃烘烤48 h后称重(干重)。含水量=(湿重-干重)/湿重。
2 结 果
2.1 3组mNSS评分比较 S组、W组和MCAO组mNSS评分依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。
2.2 3组各基因表达及mtDNA拷贝数变化比较 S组、MCAO组和W组大鼠脑组织PGC-1α和TFAM 基因表达及mtDNA拷贝数依次增高,差异有统计学意义(P<0.05)。MCAO组和W组大鼠脑组织NRF1和NRF2表达差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于S组(P<0.05)。详见表2。
组别mNSS评分(分)PGC-1αNRF1NRF2TFAMmtDNA拷贝数W组 5.30±1.651)2) 4.97±1.321)2) 3.04±1.501) 2.70±1.061) 2.89±0.201)2) 7.82±3.201)2)MCAO组 7.30±1.591) 1.86±0.611) 2.86±1.431) 2.98±1.221) 1.83±0.351) 5.50±1.421)S组 0.10±0.32 1.04±0.31 1.20±0.48 0.93±0.60 1.01±0.55 1.10±0.82 与S组比较,1)P<0.05;与MCAO组比较,2)P<0.05。
2.3 3组脑组织含水量比较 MCAO组、W组和S组大鼠患侧脑组织含水量依次降低分别为0.798±0.014,0.781±0.011与0.760±0.009,差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨 论
脑水肿是脑梗死后常见的并发症之一,常于发病后第3天~第5天达到高峰,缺氧的脑细胞发生水肿后,可使颅内压急剧增高,进一步使脑部血液灌注减少,过高颅内压压迫正常脑组织,进一步加重病情,甚至导致脑疝威胁生命[7]。
五苓散是《伤寒杂病论》中利水渗湿的代表方,具有利湿行水,温阳化气的功效,在脑梗死治疗中可作为辅助用药。本实验结果表明,五苓散可有效减轻脑缺血再灌注小鼠神经功能损伤症状,并降低脑梗死后脑水肿的严重程度,这与李星瑞等[8]研究结果一致,发现应用五苓散治疗脑梗死可有效改善病人神经功能损伤程度,但目前五苓散发挥脑保护作用的具体机制尚不明确。
线粒体是通过氧化磷酸化为细胞活动提供能量的重要细胞器,当缺血缺氧导致线粒体功能障碍时,引起细胞内乳酸堆积并影响Na+-H+交换,促进脑水肿的发生[9]。本研究探讨脑组织mtDNA拷贝数及线粒体生物合成相关基因表达的变化。结果发现,脑梗死后脑组织中mtDNA拷贝数显著增加,表明缺氧在造成线粒体损伤后,mtDNA发生代偿性扩增。一方面,mtDNA是独立存在于细胞器中的基因组DNA,其在基因组中的个数称为mtDNA拷贝数,由于缺少组蛋白保护,mtDNA易受到氧化应激、炎症等危险因素损伤,造成基因突变及线粒体功能障碍[10-11],脑梗死后,局部脑组织因氧化应激产生大量活性氧,从而造成mtDNA损伤。另一方面,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)造成mtDNA损伤同时,本身可作为第二信使,触发TFAM和NRF表达,促进线粒体扩增以降低功能障碍mtDNA所占比例,代偿能量供应水平的下降[12-13]。应用五苓散后,可见大鼠PGC-1α基因及下游TFAM基因表达进一步升高,且mtDNA拷贝数显著提高,表明五苓散可能通过激活PGC及下游通路,促进mtDNA的生物合成,增强缺血缺氧脑组织的能量供应,改善脑水肿程度,发挥脑保护作用。
综上所述,本实验通过构建脑缺血再灌注小鼠模型,初步探讨五苓散对脑水肿及线粒体生物合成基因的影响,为解释五苓散发挥脑保护作用的机制提供基础研究。脑梗死发病是多因素共同造成的,其发生发展涉及其他多条通路及靶基因,仍有待进一步研究。若能进一步探讨五苓散对其他通路的影响,可能为脑梗死的临床治疗用药及发现五苓散的新用途提供依据。
参考文献:
[1] 丁利静,李菲,石京山,等.淫羊藿苷对大脑中动脉阻塞诱导的缺血性脑卒中模型大鼠的保护作用(英文)[J].遵义医学院学报,2015,38(2):137-145.
[2] 董雯,李保玉,屈园利,等.补阳还五汤治疗脑梗死恢复期气虚血瘀证的Meta分析[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,14(6):580-585.
[3] 胡捷先,陈献华.脑缺血后谷氨酸通路及其调控的研究进展[J].复旦学报(医学版),2016,43(6):724-731.
[4] 付浩,杨小飒,余东堃,等.凋亡抑制剂zVAD对脑缺血再灌注小鼠外周血线粒体DNA拷贝数的影响[J].遵义医学院学报,2016,39(6):593-596.
[5] Malakhova L,Bezlepkin VG,Antipova V,et al.The increase in mitochondrial DNA copy number in the tissues of gamma-irradiated mice[J].Cell Mol Biol Lett,2005,10(4):721-732.
[6] Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.
[7] 宋海燕,王仙丽,伊生勇.恶性脑梗死伴脑水肿的研究进展[J].武警后勤学院学报(医学版),2016,25(7):593-596.
[8] 李星瑞,王爱梅,马聪文.加味五苓散治疗急性脑梗死后脑水肿的临床疗效观察[J].山西中医学院学报,2017,18(1):38-39.
[9] 朱志安,张红,高远征.创伤性脑水肿脑组织乳酸及线粒体SOD、MDA水平的变化[J].中国临床神经外科杂志,2000,5(2):48-50.
[10] Jokinen R,Marttinen P,Stewart JB,et al.Tissue-specific modulation of mitochondrial DNA segregation by a defect in mitochondrial division[J].Hum Mol Genet,2016,25(4):706-714.
[11] 向军军,赖菁菁,胡跃强.近3年线粒体介导细胞凋亡的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,14(13):1497-1499.
[12] Luna B,Bhatia S,Yoo C,et al.Bayesian network and mechanistic hierarchical structure modeling of increased likelihood of developing intractable childhood epilepsy from the combined effect of mtDNA variants,oxidative damage,and copy number[J].J Mol Neurosci,2014,54(4):752-766.
[13] 付浩,胡文静,王志宏,等.脑缺血再灌注小鼠线粒体DNA拷贝数与神经功能损伤相关性研究[J].现代中西医结合杂志,2017,26(1):4-6.