miR-143/145启动子区rs4705341多态性与膀胱癌的关联

刘孝德 张鹏

膀胱癌发病率高居我国泌尿系统肿瘤第一位。2015年我国膀胱癌新发病例8.05万，死亡病例3.29万[1]。膀胱癌的病因复杂，既涉及外在环境因素，例如饮食、吸烟及接触致癌物质等[2-3]，又涉及内在遗传因素，例如基因多态性。基因多态性是指随机婚配的群体中，不同个体间同一基因位点存在两种或多种不连续的基因型。按照被关注的前后顺序，通常分为三大类：DNA重复序列多态性、长度多态性和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是指基因组序列中单碱基变异造成的序列多态性，在人类基因组中广泛存在。SNP在不同人群和不同疾病状态中分布不同，其对研究疾病病因、病理进程和预后等具有重要的指导意义。

microRNA(miRNA)是长度约为18～24个核苷酸的微小RNA，本身不编码蛋白质，但是可通过靶向mRNA发挥基因调控功能，参与多种肿瘤包括膀胱癌的发生发展。多项研究证实，膀胱癌中miR-143和miR-145呈显著低表达[4-6]。人类miR-143和miR-145以簇的形式存在，具有共同的启动子区。最近有报道称，miR-143/145启动子区SNP位点rs4705341与中国人群结直肠癌的发病相关[7]。本研究选取青海地区汉族人群作为研究对象，运用病例-对照方法探讨rs4705341多态性与膀胱癌易感性的关系。

对象与方法

一、研究对象

病例组由我院泌尿外科收治的106例膀胱癌患者组成，入组病例术前未接受放化疗，术后经组织病理学检查证实为膀胱癌。对照组为162例同时期于我院行健康体检者，经B超检查证实膀胱无异常。所有研究对象均为汉族，均否认肿瘤家族史，无生物学亲缘关系。使用乙二胺四乙酸钠抗凝管采集所有研究对象外周静脉血2～3 ml，-20 ℃保存。本研究得到医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

病例组和对照组研究对象平均年龄分别为(58.8 ±9.7)岁和(57.1±10.0)岁。两组男女性别比一致，约为3∶2。年龄和性别分布上差异无统计学意义(P值分别为0.16和0.21)。病例组中，40.6%患者为非肌层浸润性膀胱癌，45.3%患者为低分级膀胱癌。病例组和对照组研究对象一般情况见表1。

表1 病例组和对照组研究对象一般情况比较 [均数±标准差，n(%)]

项目对照组病例组P值年龄 (岁)57.1±10.058.8±9.70.16性别 男93(57.4)69(65.1)0.21 女69(42.6)37(34.9)膀胱癌浸润程度 非肌层浸润性43(40.6) 肌层浸润性63(59.4)膀胱癌恶性程度 低分级48(45.3) 高分级58(54.7)

二、基因分型

应用北京百泰克公司DNA抽提试剂盒提取全血基因组DNA。运用聚合酶链反应-限制性长度片段多态性检测 rs4705341 基因型，参考相关文献[7]合成引物(上海生工生物工程有限公司)：上游：5’-CCTCGGCTTCCCAAAGTGATC-3’,下游：5’- TCCCAGCCAGATAACTGCTTTCC-3’。反应体系如下：2×PCR反应混合物5 μl，上、下游引物混合物10 μmol/L，DNA模板1 μl，加超纯水至10 μl。反应条件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35个循环)；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物由限制性内切酶 Bcl Ⅰ(NEB公司，美国)于50 ℃水浴孵育过夜，酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。rs4705341 A等位基因有一个限制性内切酶识别位点，酶切后产生2个片段，分别为106 bp和17 bp；rs4705341 G等位基因无限制性内切酶识别位点，酶切后仅有1个123 bp片段。

三、统计学方法

应用 SPSS 13.0 进行统计学分析。病例组和对照组年龄分布以均数±标准差表示，差异比较采用t检验。哈迪-温伯格平衡和rs4705341多态性相关性比较采用χ2检验。非条件logistic回归模型计算调整年龄和性别后优势比(OR)和95%置信区间(CI)。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

检测到miR-143/145启动子区 rs4705341 三种基因型，分别为AA、AG和GG(图1)，其在病例组和对照组中的分布频率均符合哈迪-温伯格平衡，P值分别为0.81和0.14。rs4705341 GG基因型在病例组中的频率(8.5%)明显低于对照组(19.1%)，经年龄和性别调整后，OR值为0.34，95%CI：0.15～0.78，P值为0.007。等位基因对比中亦观察到rs4705341降低膀胱癌的风险(G与A对比：OR=0.60，95%CI：0.41～0.87，P=0.007)。见表2。分层分析显示，rs4705341与膀胱癌浸润程度和恶性程度不存在相关性。

图1 rs4705341电泳图

表2 miR-143/145启动子区rs4705341与膀胱癌发病风险的关系 [n(%)]

讨 论

膀胱癌的发生发展不仅与编码基因的激活或失活有关，而且与非编码RNA的表达调控有关。miRNA是一类长约18～24个核苷酸的小分子非编码RNA，在膀胱癌中存在差异性表达，例如miR-143和miR-145可通过调控多条细胞信号途径抑制膀胱癌的发生[4-6]。体外和体内实验均显示，过表达miR-143或miR-145可靶向结合多个靶基因抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡，延长裸鼠生存时间，并增加细胞对顺铂和吉西他滨等化疗药物的敏感性[8-13]。由此认为，miR-143和miR-145有望成为膀胱癌新的治疗靶点。

然而，并非所有低表达miR-143和/或miR-145的个体均能罹患膀胱癌，提示miR-143/145相关的SNP可能是不同个体不同易感性的原因之一。以往研究显示，SNP不仅与膀胱癌的易感性、药物的敏感性有关，而且与膀胱癌的分期分级等临床特征相关[14-15]，已成为种群遗传分析、疾病易感性和药物研发等研究领域中的重要遗传标志。最近有报道显示，位于miR-143/145启动子区的SNP rs4705341 GG基因型携带者患结直肠癌的风险下降0.66倍，并且预示有更长的总体生存期[7]。与该研究结果相似，本研究发现携带rs4705341 GG基因型的个体患膀胱癌的风险降低了0.34倍，等位基因对比中亦发现该保护效应，提示rs4705341 GG基因型可能是膀胱癌发病的一个保护因素。

对于其可能的机制，有研究应用TRANSFAC软件预测rs4705341与转录因子结合情况，发现rs4705341 G等位基因可与转录因子GAL4结合，而A等位基因则不能。GAL4与抑癌基因p53具有相似的酸性结构域，两者重组为融合蛋白可激活p53第20～40密码子，参与基因的转录调控[16]。由此推测，rs4705341 GG基因型降低膀胱癌发病风险的可能机制是G等位基因结合了转录因子GAL4，促进miR-143和/或miR-145的转录，使得miR-143和/或miR-145表达量增加，发挥抑癌作用。其准确机制有待进一步研究。

本研究初步证实miR-143/145启动子区rs4705341 GG基因型携带者具有更低的膀胱癌患病风险。但是，由于本研究样本量较小，研究对象均为汉族个体，且地域来源单一等，可能存在一定偏倚，有必要进一步扩大样本量减少偏倚，以验证本研究结果。

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