复方大黄散对类风湿关节炎PI3K/Akt信号通路及VEGF的作用*

2018-06-02许砚秋荣晓凤

中国中医急症 2018年5期

许砚秋荣晓凤

（重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016）

类风湿关节炎（RA）是一种未见明确病因的炎症性自身免疫性疾病，其病理特征为关节滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、骨组织损伤，导致关节肿痛、僵硬、关节破坏，最终出现关节变形及功能障碍［1］。近年来发现，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、Akt是RA滑膜血管新生的重要调节因子，尤其PI3K/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路对RA的滑膜细胞增殖有重要作用。滑膜血管新生是造成RA关节软骨破坏的重要原因之一，血管内皮生长因子（VEGF）主要作用于滑膜血管内皮，增加RA微血管的通透性并刺激内皮细胞的分裂、增殖，加重RA血管翳的新生和滑膜炎症，因此通过调控PI3K/Akt、抑制VEGF，影响滑膜细胞的生长、分化、凋亡，就能控制滑膜炎症、抑制骨破坏。所以针对该信号通路及细胞因子为靶点的药物治疗就成为了新的研究热点。我们团队前期动物实验研究发现，中药复方大黄散外敷能明显降低血清及踝关节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子，改善关节的病理学形态［2-3］，因此本实验将进一步观察复方大黄散对RA患者的作用及对PI3K-AKT信号通路、VEGF的作用，为临床上应用复方大黄散治疗RA提供更多的实验室证据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 1）诊断标准：西医诊断标准参照2010年ACR的RA分类评分标准；中医诊断参照《中医病证诊断疗效标准》，符合痹证湿热痹阻证型。2）纳入标准：符合2010年ACR和EULAR的RA诊断标准，符合上述中医诊断标准；均使用甲氨蝶呤治疗，剂量每周10 mg；对实验过程知情并同意参与研究，并签署知情同意书。3）排除标准：合并有其他风湿免疫性疾病者，如系统性红斑狼疮、骨关节炎、反应性关节炎、干燥综合征、ANCA相关性血管炎等；有严重的心血管、肝、肾、消化道、内分泌等系统疾病者。

1.2 临床资料选取2016年5月至2017年8月入住重庆医科大学附属第一医院中西医结合科首次确诊为RA的患者60例，按入院先后顺序编号后随机分为观察组与对照组各30例。两组病程、年龄、治疗前血清学指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3 给药方法对照组采用甲氨蝶呤每周10 mg口服（2.5 mg/片，上海信谊生产，批准文号0361702202）；实验组采用甲氨蝶呤每周10 mg+复方大黄散外敷治疗，复方大黄散由大黄、栀子、红花按 1.2∶1.2∶1碾磨成粉后混匀，经7号筛120目后加蒸馏水搅拌成糊状，均匀敷布于纱布上，厚度约2 mm，覆盖于患处约1 h，每天1次。所有中药饮片由重庆医科大学附属第一医院中药房提供，疗程1个月。

1.4 观察指标 1）标本采集：治疗前和治疗后分别采集患者血清。于清晨空腹采集患者5 mL血液，用不加抗凝剂的真空管抽取，常温下静置30 min后，用4℃离机，以3000 r/min离心10 min，抽取上清液，放于标好号的EP管中，并用封口胶密封，保存于-80℃冰箱内，以备集中检测。2）关节疼痛评估：使用VAS评分，评分标准为0～10分。0分为无痛；3分以下为有轻微的疼痛，能忍受；4～6分为患者疼痛并影响睡眠，尚能忍受；7～10分为患者有逐渐强烈的难以忍受的疼痛感，影响食欲和睡眠。3）疗效评分：根据欧洲风湿病联盟（EULAR）的疗效评分标准，以DAS28为标准，判断RA患者疾病活动度，△DAS28≥1.2，DAS28≤2.6 分，表明病情处于缓解期；△DAS28≥1.2，2.6分＜DAS28≤3.2分，表明病情处于轻度活动期；△DAS28≥1.2，3.2分＜DAS28≤5.1 分，或 0.6＜△DAS28≤1.2，DAS≤5.1 分，则病情处于中度活动期；△DAS28≥1.2，DAS28＞5.1分，说明病情处于重度活动期。4）血常规、肝功、肾功均由全自动生化检测仪测得；免疫比浊法测定类风湿因子（RF）、C 反应蛋白（CRP）；魏氏法测血沉（ESR）。以上临床指标均由重庆医科大学附属第一医院医学检验科检测。5）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗CCP抗体、PI3K、AKT、VEGF，方法均按照试剂盒说明书，试剂盒购自天津安诺瑞康生物技术有限公司。

1.5 统计学处理应用SPSS21.0统计软件。计量资料正态分布以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，PI3K、AKT、VEGF水平与DAS28积分间的相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组1例患者失访，共统计29例；观察组统计30例。

2.1 两组肿胀关节数、压痛关节数、VAS评分和DAS28评分比较见表1。治疗后两组关节肿胀数、关节压痛数、VAS评分、DAS28评分较治疗前均有显著下降（P＜0.05），治疗后观察组肿胀关节数、VAS评分、DAS28评分较对照组下降更明显（P＜0.05）。

表1 两组肿胀关节数、压痛关节数、VAS评分和DAS28 评分比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，△P＜0.05。下同。

组别时间关节肿胀数关节压痛数 VAS评分（分）DAS28评分（分）观察组治疗前（n＝30）治疗后对照组治疗前13.87±4.83 12.40±5.53 4.72±1.58 6.43±0.60 4.23±2.73*△ 5.53±3.83*△ 1.52±1.21*△ 4.59±0.70*△13.07±4.32 11.80±4.23 4.80±1.38 6.25±0.57（n＝29）治疗后8.57±3.08* 6.90±3.62* 2.13±0.86* 5.39±0.55*

2.2 两组血清CRP、ESR、RF、抗CCP抗体水平比较见表2。治疗后，观察组与对照组患者血清ESR、RF、抗CCP抗体均较治疗前有下降，其中ESR、RF以观察组下降最明显（P＜0.05），对照组治疗前后差异无统计学意义（P＜0.05）。观察组CRP值治疗前后有明显下降（P＜0.05），而对照组CRP值无明显下降。

表2 两组治疗前后血清CRP、ESR、RF、抗CCP水平比较（±s）

组别时间CRP（mg/L） ESR（mm/h）RF（IU/mL）抗 CCP（U/mL）观察组治疗前（n＝30）治疗后对照组治疗前34.02±34.60 63±20 726±1040 724±636 13.89±21.79* 46±26* 103±165* 720±758 27.78±29.81 56±23 418±646 688±602（n＝29）治疗后35.56±62.66 47±21 162±116 528±525

2.3 两组血清PI3K、Akt、VEGF水平比较见表3。实验组治疗后PI3K、Akt、VEGF水平均较治疗前下降，其中Akt差异有统计学意义（P＜0.05），对照组治疗后PI3K、Akt水平较治疗前有所下降，但并无明显差异（P＞0.05），治疗后观察组VEGF、Akt水平比对照组低，其中Akt水平的下降差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组血清 PI3K、Akt、VEGF 水平比较（±s）

组别时间 VEGF（pg/mL）PI3K（pmol/L） Akt（ng/mL）观察组治疗前 495±560（n＝30）治疗后 274±212对照组治疗前 480±650 35±14 47.5±25.1 34±13 23.2±7.3*△35±12 43.4±16.0（n＝29）治疗后 647±590 27±7 40.0±8.0

2.4 不良反应治疗后实验组有2例出现白细胞减少（白细胞计数：2.6～3.2×109/L）。治疗后对照组有2例出现白细胞减少，此例患者治疗前白细胞水平已低于正常值。观察组和对照组均未见肝肾功能损害。观察组有1例11 d后在敷药部位出现皮肤轻微瘙痒发红，局部无肿胀破溃，经对症处理后均好转。

3 讨论

RA是一种累积关节滑膜组织，导致骨破坏的慢性自身免疫性疾病。其基本病理表现为滑膜炎、血管翳形成，并受信号通路、细胞因子等多种因素调节，其中与PI3K/Akt信号通路、VEGF密切相关。PI3K/Akt信号通路有抗成纤维滑膜细胞凋亡并引起其异常增殖的作用，有研究显示RA患者滑膜细胞中Akt存在过度表达，PI3K能够活化Akt，而Akt能磷酸化多种靶蛋白产生抑制细胞凋亡的效应［4-5］，所以通过抑制异常活化的PI3K/Akt通路可以诱导类风湿成纤维滑膜样细胞的凋亡，抑制滑膜增殖，控制RA病情活动。另外在RA中，VEGF也有抗滑膜血管翳细胞凋亡的作用，并能促进滑膜细胞的增生。其通过与VEGF受体（VEGFR）结合，促进内皮细胞迁移、增殖、分化和增加血管通透性，从而促进血管翳的形成和炎症反应的发生［6］。所以抑制PI3K/AKT信号通路、VEGF的生成，就成为RA治疗的切入点。

治疗类风湿关节炎的药物包括非甾体抗炎药（NSAIDS）、改善病情的抗风湿药（DMARDS）、糖皮质激素、生物制剂、靶向小分子药物以及植物药［7-8］。非甾体抗炎药在关节疼痛急性期起到了很好的作用，通过抑制环氧化酶的活性，减少炎症因子前列腺素的合成，抑制炎症反应。但长期服用易引起上消化道出血、肝肾功能不良等。DMARDS作为RA基础用药，能延缓关节炎的发病进展，但对RA急性期的关节疼痛、肿胀无明显改善。常用的DMARDS药物有：来氟米特、甲氨蝶呤、羟氯喹等。而糖皮质激素相较于DMARDS，不仅能延缓病情进展，还能通过基因调节机制减少促炎细胞因子的转录，从而缓解关节疼痛。所以常与DMARDS联合使用，但糖皮质激素有引起骨质疏松、诱发加重感染及消化系统疾病等不良反应，停用后病情常反复。故针对缓解关节疼痛、预防骨破坏的生物制剂就成为RA治疗的一大突破，但其价格相对昂贵，是传统DMARDS疗效不佳的后备药物［9］。而植物药既能抗炎、改善关节疼痛，又具备免疫抑制、免疫调节效应，但其有肝肾毒性、对生殖系统有不良反应［7，10-11］。近年来靶向小分子药物成为研究热点，如：JAK/STAT信号通路抑制剂通过阻断细胞因子的级联放大作用，改善RA受损关节症状，但其有严重感染、诱发恶性肿瘤的风险。因此，选择安全有效的抗风湿药成为医者关注的重点。

中医药有良好的抗炎、镇痛和免疫调节作用，近年来在RA的治疗中占有很重要的地位。RA属中医痹证范围。“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”是《黄帝内经》最早提出的致病病因。风寒湿入侵，久则化热，瘀阻经络，致关节反复肿痛，最终引起畸形。因此“湿热瘀阻筋脉”是RA急性期关节肿痛的主要病机特点，治宜清热除湿、通络止痛。复方大黄散是我们长期临床实践筛选出的外敷治疗RA的有效经验方，由大黄、栀子、红花组成。现代文献无大黄治疗RA的报道，但早在《圣惠》记载的“大黄散”“大黄饮子”及《三因极·病证方论》卷三记载的“大黄左经汤”等方，均以大黄为主药，治疗“肢节烦疼”“腰脚痹痛”等。因此以大黄为君，逐瘀通经、清热泻火；栀子为臣，凉血散瘀、清热利湿；红花为佐，活血通经，祛瘀止痛。诸药相配，共成清热除湿、活血止痛之效。有文献报道，大黄中的有效成分主要为大黄素，且能降低VEGF的水平［12］。栀子的有效成分栀子总苷可抑制早期炎症的渗出和水肿，增加抗炎镇痛作用［13］。红花能明显改善机体的免疫功能，并且有较强的抗炎镇痛作用［14］。前期研究已证实复方大黄散能使佐剂性关节炎大鼠踝关节肿胀明显缓解，血清及踝关节TNF-α水平明显下降，作用与外敷扶他林效果相当，比口服药物更安全［15］。表明该方药对RA大鼠有良好抗炎消肿、抑制致炎因子的作用。

本研究发现，外敷复方大黄散联合甲氨蝶呤治疗RA患者1个月后，较单纯口服甲氨蝶呤的患者在关节疼痛数量、肿胀数量、疼痛程度上改善效果更佳；VAS评分、DAS28评分及ESR、RF、CRP水平均较治疗前明显下降，再次证实了复方大黄散能明显减轻RA患者关节肿胀疼痛，控制RA炎症活动，联合DMARDs能缩短病程，起到协同增效之功。

观察结果提示，实验组患者血清PI3K、Akt、VEGF水平较治疗前降低，说明外敷复方大黄散在一定程度上通过透皮吸收可能抑制PI3K/Akt信号通路及VEGF表达，从而抑制RA关节滑膜炎症。本研究首次证实了复方大黄散联合甲氨蝶呤相比于单用甲氨蝶呤对PI3K/Akt信号通路有更大的影响，同时也说明了复方大黄散能降低VEGF的水平。另一方面，本研究实验组与对照组治疗后Akt水平有显著差异，但PI3K水平并未见明显差异，提示复方大黄散的作用靶点可能在Akt，但另一种可能为本观察周期短、样本量不足，有待今后进一步深入研究。本实验并未发现复方大黄散存在血常规、肝功损害等安全性问题，和前期动物实验结果一致。

综上所述，口服传统DMARDS联合外敷复方大黄散，对关节红肿热痛有较好抗炎止痛作用，并能有效降低血清PI3K、Akt、VEGF浓度，且无明显不良反应。表明甲氨蝶呤联合复方大黄散外敷，能显著改善RA患者关节疼痛、肿胀症状，对患者关节炎症起到很好的抑制作用。其作用机制之一可能与抑制PI3K/Akt信号通路及VEGF表达相关。本研究结果对于RA急性发作时的治疗提出了一条新的思路。

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